Uracil DNA Glycosylase
Uracil-DNA Glycosylase (UNG eller UDG) er en rekombinant klon af E. coli med en molekylvægt på 25 kDa.Det katalyserer frigivelsen af frit uracil fra uracil-holdigt enkeltstrenget og dobbeltstrenget DNA og er inaktivt mod RNA og kan bruges til at forhindre kontaminering af PCR-amplifikationsprodukter.Virkningsprincippet er baseret på, at hvis dUTP erstattes med dTTP i PCR-reaktionen og der dannes et PCR-amplifikationsprodukt indeholdende dU-baser, kan enzymet selektivt bryde U-basernes glykosidbinding i enkeltstrengede og dobbeltstrengede DNA og nedbryde PCR-amplifikationsproduktet.
Anbefalet anvendelse
Kontamineringsforebyggende amplifikation
Opbevaringstilstand
-20°C til langtidsopbevaring, bør blandes godt før brug, undgå hyppig frysning-optøning.
Opbevaringsbuffer
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, stabilisator, 50% glycerol.
Enhedsdefinition
Mængden af enzym, der kræves for at nedbryde 1 µg enkeltstrenget DNA indeholdende dU-baser på 1 time ved 37°C, er 1 enhed.
Kvalitetskontrol
1.SDS-PAGE elektroforetisk renhed større end 98 %
2.Amplifikationsfølsomhed, batch-til-batch kontrol, stabilitet
3.Efter at 1 U UNG er behandlet ved 50 ℃ i 2 minutter, bør skabelonen, der indeholder U under 103 kopier, være fuldstændig nedbrudt, og der kan ikke produceres noget amplifikationsprodukt
4.Ingen eksogen nukleaseaktivitet
Instruktioner
| Komponenter | Volumen (μL) | Slutkoncentration |
| 10 × PCR-buffer (dNTP-fri, Mg²+gratis) | 5 | 1× |
| dUTP'er (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (erstat dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Primer Mix-en | 2 | 1× |
| Skabelon | - | ＜1μg/reaktion |
| ddH2O | Til 50 | - |
Bemærk: a: Hvis den bruges til qPCR/qRT-PCR, skal den fluorescerende probe tilføjes reaktionssystemet.Normalt kan en endelig primerkoncentration på 0,2 μM give gode resultater;når reaktionsydelsen er dårlig, kan primerkoncentrationen justeres i området 0,2-1 μM.Normalt er probekoncentrationen optimeret i området 0,1-0,3 μM.Koncentrationsgradientforsøg kan udføres for at finde den bedste kombination af primer og probe.
Noter
1.UNG-enzym kan bruges til at fjerne de kontaminerede dUTP-amplifikationsprodukter fra reaktionssystemet før PCR-amplifikationsreaktionen, for derefter at undgå falsk-positive resultater på grund af produktkontamination.
2.Den optimale temperatur for UNG-enzym, der skal bruges i PCR-reaktionen mod kontaminering, er generelt 50 ℃ i 2 minutter;inaktiveringstilstanden er 95 ℃ i 5 minutter.
3.Undgå hyppig frysning-optøning, og udsæt ikke for store temperaturudsving.
4.Forskellige gener, der skal amplificeres, har forskellig udnyttelseseffektivitet af dUTP og følsomhed over for UNG-enzym, derfor, hvis brugen af UNG-system fører til et fald i detektionsfølsomheden, bør reaktionssystemet justeres og optimeres, hvis du har brug for teknisk support, kontakt venligst vores firma.
