Superstart qPCR Premix plus-UNG
Kat. nr.: HCB5071E
Superstart qPCR Premix plus-UNG er et specialiseret reagens designet til realtids PCR kvalitative og kvantitative reaktioner ved hjælp af probebaseret detektion, udviklet specifikt til frysetørringsprocesser.Den indeholder et nyt hotstart-enzym Hotstart Taq plus (DG), som har sin Taq-enzymaktivitet forseglet ved stuetemperatur, hvilket effektivt hæmmer ikke-specifik amplifikation forårsaget af primer-uspecifik annealing eller primer-dimer-dannelse under lave temperaturforhold og dermed forbedrer specificiteten af amplifikationsreaktionen.Dette reagens bruger en optimeret qPCR-specifik buffer og UNG/dUTP anti-kontaminationssystem for at opnå hurtig varmstart, hvilket i høj grad forbedrer effektiviteten og følsomheden af qPCR-reaktioner.Det kan opnå gode standardkurver i en lang række kvantificeringsområder og nøjagtigt udføre kvantificering, hvilket effektivt forhindrer falsk positiv amplifikation forårsaget af resterende PCR-produkter eller aerosolkontamination.Dette reagens er kompatibelt med de fleste fluorescerende kvantitative PCR-instrumenter fra producenter som Applied Biosystems, Eppendorf, BioRad og Roche osv., og udviser god stabilitet i frysetørret form.
Reagenssammensætning
1. 5×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+gratis) (DG)
2. 250 mM MgCl2
3. 4 x lyoprotectant (valgfrit)
Opbevaringsbetingelser
Langtidsopbevaring ved -20 ℃;kan opbevares ved 4℃ i op til 3 måneder.Bland godt inden brug ogundgå gentagen frysning og optøning.
Cykelprotokol
| Procedure | Midlertidig. | Tid | Cyklus |
| Fordøjelse | 50 ℃ | 2 min | 1 |
| Polymerase aktivering | 95℃ | 1~5 min | 1 |
| Denaturering | 95℃ | 10~20 sek | 40-50 |
| Udglødning og forlængelse | 56~64℃ | 20~60 sek | 40-50 |
qPCR væskereaktion Systamforberedelse
|
Sammensætning |
25 µL volumen |
50 µL volumen |
Endelig koncentration |
| 5×HotstartPremix plus-UNG(Mg2+gratis) (DG) | 5 µL | 10 µL | 1× |
| 250 mM MgCl2 | 0,45 µL | 0,9 µL | 4,5 mM |
| 4×lyoprotectant1 | 6,25 µL | 12,5 µL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mix2 | 1 µL | 2 µL | 1× |
| Skabelon DNA3 | —— | —— | —— |
| ddH2O | Til 25 µL | Til 50 µL | —— |
1. En slutkoncentration på 0,2μM for primere giver normalt gode resultater;Når reaktionsydelsen er dårlig, justeres primerkoncentrationen inden for området 0,2-1μM efter behov.Probekoncentrationen optimeres typisk inden for området 0,1-0,3μM gennem gradienteksperimenter for at finde optimale kombinationer.
2. Kopiantallet af målgener indeholdt i forskellige typer skabeloner varierer;om nødvendigt kan gradientfortynding udføres for at bestemme den optimale skabelontilsætningsmængde.
3. Dette system kan lyofiliseres;når kunder bruger dette system uden krav til frysetørring, kan 4× lyoprotectant tilsættes selektivt; hvis der er behov for frysetørrede produkter, skal det under validering af produktets ydeevne på flydende reagenstrin tilsætte 4× lyoprotectant for at sikre overensstemmelse med de lyofiliserede systemkomponenter og effekter.
Når systemet er i brugd til frysetørring forberedes system as følge:
| Sammensætning | 25µL Reaktionssystem |
| 5 ×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+gratis) (DG) | 5 µL |
| 250 mM MgCl2 | 0,45 µL |
| 4×lyoprotectant | 6,25 µL |
| 25×Primer-Probe Mix | 1 µL |
| ddH2O | Til 18~20µL |
* Hvis andre systemer til frysetørring er nødvendige, bedes du konsultere separat.
Lyofiliseringsproceduress
| Procedure | Midlertidig. | Tid | Tilstand | Tryk |
| Forfrysning | 4℃ | 30 min | Holde |
1 atm |
| -50 ℃ | 60 min | Køling | ||
| -50 ℃ | 180 min | Holde | ||
| Primær tørring | -30℃ | 60 min | Opvarmning |
Ultimativt vakuum |
| -30℃ | 70 min | Holde | ||
| Sekundær tørring | 25℃ | 60 min | Opvarmning |
Ultimativt vakuum |
| 25℃ | 300 min | Holde |
2. Ovenstående lyofiliseringsproces er kun til reference.Forskellige produkttyper og forskellige frysetørrere har forskellige parametre, så der kan justeres efter faktiske forholdforhold under brug.
3. Forskellige lyofiliseringsprocesser kan være egnede til forskellige batchstørrelser af frysetørretprodukter, så der skal udføres tilstrækkelig testvalidering, når de bruges til produktion i stor skala.
Instruktion til brug af frysetørringd pulver
1. Centrifuger kort det frysetørrede pulver;
2. Tilføj nukleinsyreskabelon til det lyofiliserede pulver og tilsæt vand op til 25 µL;
3. Bland godt ved centrifugering og kør på maskine.
Kvalitetskontrol:
1. Funktionel test: sensitivitet, specificitet, reproducerbarhed af qPCR.
2. Ingen eksogen nukleaseaktivitet, ingen eksogen endo/exonukleasekontamination.
Teknisk information:
1. Superstart qPCR Premix plus-UNG bruger et nyt hot-start enzym, der muliggør hurtig varmstart inden for 1~5 minutter;gennem en speciel bufferformulering er den velegnet til multipleks fluorescerende kvantitative PCR-reaktioner.
2. Det har højere specificitet, som væsentligt forbedrer følsomheden af fluorescens kvantitativ PCR grænse detektion, hvilket gør amplifikationskurver normalisering, fluorescens værdi opnår åbenlys forbedring ved lav koncentration skabeloner, egnet som høj følsomhed fluorescens kvantitative PCR detektionsreagenser.
3. For primere med lavere annealingstemperatur eller længere end 200 bp fragmenter anbefales en 3-trins metode.
4. Udnyttelseseffektiviteten af dUTP og følsomhed over for UNG-enzym er forskellig for forskellige målgener, så hvis brug af UNG-system fører til et fald i detektionsfølsomhed, bør reaktionssystemet justeres og optimeres.Hvis der er behov for teknisk support, kontakt venligst vores virksomhed.
5. Brug dedikerede områder og pipetter før og efter amplifikation, brug handsker under drift og udskift dem ofte;Åbn ikke reaktionsrøret efter PCR-afslutning for at minimere kontaminering af prøver med PCR-produkter.
