Hotstart Taq DNA Polymerase
Hot Start Taq DNA-polymerase (antistofmodifikation) er en varm-start termostabil DNA-polymerase fra Thermus aquaticus YT-1, som har en 5′→3′ polymeraseaktivitet og en 5′ flap endonukleaseaktivitet.Hot-start Taq DNA polymerase er en Taq DNA polymerase, som er modificeret af termolabile Taq antistoffer.Antistofmodifikation øgede specificitet, sensitivitet og udbytte af PCR.
Komponenter
| Komponent | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq Buffer | 4×1 ml | 4×10 ml | 4×50 ml | 5×400 ml |
| Hot Start Taq DNA-polymerase (antistofmodificeret) (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 10×5 ml |
Ansøgninger
10 mM Tris-HCl (pH 7,4 ved 25 ℃), 100 mM KCI, 0,1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0,5 % Tween20, 0,5 % IGEPALCA-630 og 50 % Glycerol.
Opbevaringstilstand
Transport under 0°C og opbevares ved -25°C~-15°C.
Enhedsdefinition
En enhed er defineret som mængden af enzym, der inkorporerer 15 nmol dNTP i syreuopløseligt materiale på 30 minutter ved 75°C.
Kvalitetskontrol
1.Endonuclease aktivitet:Inkubation af 20 U enzym med 4 μg pUC19 DNA i 4 timer ved 37 ℃ resulterede i ingen påviselig nedbrydning af DNA'et som bestemt ved gelelektroforese.
2.5 kb Lambda PCR:25 PCR-amplifikationscyklusser af 5 ng lambda-DNA med 1,25 enheder Taq DNA-polymerase i nærvær af 200 µM dNTP'er og 0,2 µM primere resulterer i det forventede 5 kb-produkt.
3.Exonuklease aktivitet:Inkubation af en 50 µl reaktion indeholdende minimum 12,5 U Taq DNA-polymerase med 10 nmol 5'-FAM oligonukleotid i 30 minutter ved 37 ℃ giver ingen påviselig nedbrydning.
4.RNase aktivitet:Inkubation af 10 µL reaktion indeholdende 20 U enzym med 1 μg RNA-transkripter i 2 timer ved 37°C resulterede i ingen påviselig nedbrydning af RNA'et som bestemt ved gelelektroforese.
5.Varme inaktivering:Ingen.
Reaktionssystem
| Komponenter | Bind |
| Skabelon DNAa | valgfri |
| 10 μM Forward Primer | 0,5 μL |
| 10 μM Reverse Primer | 0,5 μL |
| dNTP Mix (10 mM hver) | 0,5 μL |
| 5×HC Taq Buffer | 5 μL |
| Taq DNA polymeraseb(5U/μL) | 0,125 μL |
| Nukleasefrit vand | Op til 25 μL |
Bemærkninger:
1) a.
| DNA | Beløb |
| Genomisk | 1 ng-1 μg |
| Plasmid eller viral | 1 pg-1 ng |
2) b.Den optimale koncentration af Taq DNA-polymerase kan variere fra 5-50 enheder/ml (0,1-0,5 enheder/25 µL reaktion) i specialiserede applikationer.
Termisk cyklingsprotokol
PCR
| Trin | Temperatur(°C) | Tid | Cykler |
| Indledende denatureringa | 95 ℃ | 1-3 min | - |
| Denaturering | 95 ℃ | 15-30 sek | 30-35 cyklusser |
| Udglødningb | 45-68 ℃ | 15-60 sek | |
| Udvidelse | 68 ℃ | 1 kb/min | |
| Endelig udvidelse | 68 ℃ | 5 min | - |
Bemærkninger:
1) En initial denaturering på 1 min ved 95°C er tilstrækkelig til de fleste amplifikationer.For vanskelige skabeloner anbefales en længere denaturering på 2-3 minutter ved 95°C.Med koloni-PCR anbefales en indledende 5 minutters denaturering ved 95°C.
2) Udglødningstrinnet er typisk 15-60 s.Udglødningstemperaturen er baseret på Tm for primerparret og er typisk 45-68 ℃.
