Proteinase K mNGS (væske)
Proteinase K er en stabil serinprotease med bred substratspecificitet.Det nedbryder mange proteiner i den oprindelige tilstand, selv i nærvær af rengøringsmidler.Beviser fra undersøgelser af krystal og molekylær struktur indikerer, at enzymet tilhører subtilisin-familien med en aktiv site-katalytisk triade (Asp39-Hans69- Ser224).Det dominerende sted for spaltning er peptidbindingen, der støder op til carboxylgruppen af alifatiske og aromatiske aminosyrer med blokerede alfa-aminogrupper.Det er almindeligt anvendt for dets brede specificitet.Denne proteinase K er specielt designet til mNGS.Sammenlignet med den anden proteinase K indeholder den endnu mindre nukleinsyrekontamination med den samme enzymatiske ydeevne, hvilket bedre kunne sikre nedstrøms mNGS-applikationen.
Opbevaringsbetingelser
2-8℃ i 2 år
Specifikation
| Udseende | Farveløs til lysebrun væske |
| Aktivitet | ≥800 U/ml |
| Proteinkoncentration | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Ingen fundet |
| DNase | Ingen fundet |
| RNase | Ingen fundet |
Ejendomme
| EF-nummer | 3.4.21.64(Rekombinant fra Tritirachium album) |
| Isoelektrisk punkt | 7,81 |
| Optimal pH | 7,0- 12,0 Fig. 1 |
| Optimal temperatur | 65 ℃ Fig. 2 |
| pH-stabilitet | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 timer) Fig. 3 |
| Termisk stabilitet | Under 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Fig. 4 |
| Opbevaringsstabilitet | Over 90 % aktivitet i 12 måneder ved 25 ℃ |
| Aktivatorer | SDS, urinstof |
| Inhibitorer | diisopropylfluorphosphat;phenylmethylsulfonylfluorid |
Ansøgninger
1. Genetisk diagnostisk kit
2. RNA- og DNA-ekstraktionssæt
3. Ekstraktion af ikke-proteinkomponenter fra væv, nedbrydning af proteinurenheder, såsom DNAvacciner og fremstilling af heparin
4. Fremstilling af kromosom-DNA ved pulserende elektroforese
5. Western blot
6. Enzymatisk glycosyleret albuminreagenser in vitro-diagnose
Forholdsregler
Bær beskyttelseshandsker og beskyttelsesbriller ved brug eller vejning, og hold godt ventileret efter brug.Dette produkt kan forårsage allergisk hudreaktion og alvorlig øjenirritation.Hvis det indåndes, kan det forårsage allergi- eller astmasymptomer eller dyspnø.Kan forårsage irritation af luftvejene.
Enhedsdefinition
En enhed (U) er defineret som den mængde enzym, der kræves for at hydrolysere kasein for at producere 1 μmoltyrosin pr. minut under følgende betingelser.
Klargøring af reagenser
Reagens I: 1 g mælkekasein blev opløst i 50 ml 0,1 M natriumphosphatopløsning (pH 8,0), inkuberet i 65-70 ℃ vand i 15 minutter, omrørt og opløst, afkølet med vand, justeret med natriumhydroxid til pH 8,0 og fast volumen 100 ml.
Reagens II: 0,1 M trichloreddikesyre, 0,2 M natriumacetat, 0,3 M eddikesyre.
Reagens III: 0,4 M Na2CO3løsning.
Reagens IV: Forint-reagens fortyndet med rent vand i 5 gange.
Reagens V: Enzymfortynder: 0,1 M natriumphosphatopløsning (pH 8,0).
Reagens VI: tyrosinopløsning: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tyrosin opløst med 0,2M HCl.
Procedure
1. 0,5 ml reagens I forvarmes til 37 ℃, tilsæt 0,5 ml enzymopløsning, bland godt og inkuber ved37℃ i 10 min.
2. Tilsæt 1 ml reagens II for at stoppe reaktionen, bland godt og fortsæt inkubationen i 30 minutter.
3. Centrifuger reaktionsopløsning.
4. Tag 0,5 ml supernatant, tilsæt 2,5 ml reagens III, 0,5 ml reagens IV, bland godt og inkuber ved 37 ℃i 30 min.
5. OD660blev bestemt som OD1;blank kontrolgruppe: 0,5 ml reagens V bruges til at erstatte enzymløsning til at bestemme OD660som OD2ΔOD=OD1-OD2.
6. L-tyrosin standardkurve: 0,5 ml forskellig koncentration af L-tyrosinopløsning, 2,5 ml reagens III, 0,5 ml reagens IV i 5 ml centrifugerør, inkuber i 37 ℃ i 30 minutter, påvis for OD660for forskellig koncentration af L-tyrosin, opnåedes derefter standardkurven Y=kX+b, hvor Y er L-tyrosinkoncentrationen, X er OD600.
Beregning
2: Total volumen af reaktionsopløsning (ml)
0,5: Volumen af enzymopløsning (ml)
0,5: Reaktionsvæskevolumen brugt til kromogenbestemmelse (mL)
10: Reaktionstid (min)
Df: Fortynding multipel
C: Enzymkoncentration (mg/ml)
Referencer
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biofys.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103-108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. udgave, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Figurer
Fig.1 Optimal pH
100 mM bufferopløsning: pH 6,0-8,0, Na-phosphat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH9,0-12,5, Glycin-NaOH. Enzymkoncentration: 1mg/ml
Fig.2 Optimal temperatur
Reaktion i 20 mM K-phosphatbuffer pH 8,0.Enzymkoncentration: 1 mg/ml
Fig. 3 pH Stabilitet
25 ℃, 16 timers behandling med 50 mM bufferopløsning: pH 4,5-5,5, Acetat;pH 6,0-8,0, Na-phosphat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, Glycin-NaOH.Enzymkoncentration: 1 mg/ml
Fig.4 Termisk stabilitet
30 min-behandling med 50 mM Tris-HCl-buffer, pH 8,0.Enzymkoncentration: 1 mg/ml
Fig.5 Opbevaring stability at 25℃
