2×Sensi Direct Premix-UNG (Probe qPCR)
Kat. nr.: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) er designet til at udføre PCR direkte fra prøver uden DNA-ekstraktion eller prøveforberedelse.Dette reagens består af hot-start DNA polymerase, uracil DNA glycosylase (UNG), RNase inhibitor, MgCl2, dNTP'er (med dUTP i stedet for dTTP) og stabilisatorer til kvantitativ PCR (qPCR).Dette reagens præformer høj inhibitor-tolerance, og det kan derfor anvendes direkte til påvisning af prøver som halspodning, spyt, anti-koaguleret fuldblod, plasma og serum uden DNA-ekstraktion.Reagenset bruger proprietær buffer til qPCR med blandede enzymer af anti-inhiberende DNA-polymerase og UNG-enzym.Derfor kan det opnå en god amplifikation af målgener i prøver indeholdende inhibitorer og hæmme falsk positiv amplifikation forårsaget af PCR-rest- og aerosolforurening.Dette reagens er kompatibelt med de fleste fluorescerende kvantitative PCR-instrumenter, såsom Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche og så videre.
Komponenter
1. 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix
2. 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP)
Opbevaringsforhold
Alle komponenter skal opbevares ved -20 ℃ til langtidsopbevaring og 4 ℃ i op til 3 måneder.Bland venligst grundigt efter optøning og centrifuger før brug.Undgå hyppig frysning-optøning.
Cykelprotokol
| Trin | Temperatur | Tid | Cyklus |
| Fordøjelse | 50 ℃ | 2 min | 1 |
| Polymerase aktivering | 95℃ | 1-5 min | 1 |
| Denaturering | 95℃ | 10-20 s | 40-50 |
| Udglødning/forlængelse | 56-64℃ | 20-60'erne |
Pipetteringsinstruktioner
| Reagens | Volumen pr reaktion | Volumen pr. reaktion | Endelig koncentration |
| 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP) | 12,5 µL | 25 µL | 1× |
| 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix | 0,5 µL | 1 µL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mix1, 2 | 1 µL | 2 µL | 1× |
| Prøve3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Samlet volumen | 25 μL | 50 μL | - |
1. Den endelige koncentration af primer er normalt 0,2μM.For bedre resultater kan primerkoncentrationen optimeres inden for området 0,2-1μM.
2. Generelt kan probekoncentrationen optimeres inden for området 0,1-0,3μM.Den optimale koncentration af proben er relateret til real-time PCR-amplifikationsinstrumentet, typen af probe og typen af fluorescerende mærkningsstof.Se venligst instrumentmanualen eller de specifikke krav til hver fluorescerende probe.
3. Forskellige typer prøver indeholder forskellige typer og indhold af inhibitor og kopinummer af målgen.Prøvevolumenet bør tages i betragtning ud fra den faktiske tilstand.Lav en fortynding af prøven ved at tilsætte nukleasefrit vand eller TE-buffer, hvis det er nødvendigt.
4. Anbefalet mængde af forskellige prøver:
| Prøve | Volumen for en 50 μL reaktion | Maksimum forhold |
| Antikoaguleret fuldblod | 2,5 μL | 5% |
| Plasma | 15 μL | 30 % |
| Serum | 10 μL | 20 % |
| Halsprøve | 10 μL | 20 % |
| Spyt | 10 μL | 20 % |
Kvalitetskontrol
1. Funktionsdetektion: sensitivitet, specificitet og repeterbarhed af qPCR.
2. Ingen eksogen nukleaseaktivitet: ingen exogen endonuklease og exonukleaseforurening.
Noter om produktet
1. Dette produkt anvender en ny type hot-start DNA-polymerase, som kan aktiveres på 1-5 minutter. Da dets reaktionsbuffer er blevet optimeret, er det mere egnet til dobbelt eller multiple fluorescens kvantitativ PCR ved hjælp af probemetoden.
2. Hvis Rn-værdien af PCR-amplifikationen er for lav, eller amplifikationen åbenlyst er hæmmet, kan en reduktion af prøvemængden, øget reaktionsvolumen eller tidligere fortynding af prøven forbedre resultaterne.
3. Indsamling af blod, spyt, urin, svælgpodning osv. bør følge de kliniske kriterier, og frisk prøve kan bruges til at forhindre nedbrydning af nukleinsyre.
4. Da forskellige amplikoner har forskellig udnyttelseseffektivitet end dUTP og følsomhed over for UNG, bør reagenserne optimeres, hvis detektionsfølsomheden falder ved brug af UNG-system.Kontakt os venligst for teknisk support, hvis det er nødvendigt.
5. For at undgå amplifikation af overførte PCR-produkter mellem et-trins-reaktioner kræves et dedikeret forsøgsområde og pipette til amplifikation.Arbejd med handsker og skift ofte, og åbn ikke reaktionsrøret efter PCR-amplifikation.
