Plant direkte PCR Kit

Kat. nr.: HCR2020A

Plant Direct PCR Kit er velegnet til direkte amplifikation af planteblade, frø osv., og kan bruges til high-throughput screening af planteprøver, der ikke indeholder polysaccharider og polyphenoler.Den direkte amplifikations-DNA-polymerase baseret på den rettede udvikling har overlegen tolerance over for PCR-hæmmere i planter.I mellemtiden opretholder den den høje amplifikationsydelse, som er egnet til amplifikation af DNA-fragmenter inden for 5 kb.Den unikke Lysis-buffer A i sættet kan bruges til at lysere friske eller frosne plantevæv.Det er nemt at betjene, og lysatet kan bruges som skabelon til amplifikation uden oprensning.Systemet indeholder beskyttelsesmidler, der gør det muligt at forstærke råprøver effektivt efter gentagen frysning og optøning.2 × Plant Direct Master Mix behøver kun at tilføje primere og skabeloner for at udføre amplifikationsreaktion og derved reducere pipettering og forbedre detektionsgennemløb og reproducerbarhed af resultater.

Komponenter

*Plant Direct Lysis Buffer B er et valgfrit reagens, som bruges til at neutralisere Plant Direct Lysis Buffer A for at forlænge opbevaringstiden for prøver.Det kan bruges i henhold til den faktiske situation.

Opbevaringsbetingelser

2 × Plant Direct Master Mix, opbevares ved -30 ~ -15 ℃ og undgå gentagen frysning og optøning;Plant direkte lysisbuffer, opbevares ved -30 ~ -15 ℃ eller 2 ~ 8 ℃.

Eksperiment proces

Prøvebehandling–Planteblad

Direkte metode:Det anbefales at bruge unge blade.Brug en hulmaskine med en fast diameter på 0,5 – 3 mm for at opnå en lille og ensartet prøve, og tilsæt derefter prøven direkte til PCR-systemet (50 μl system anbefales).Bemærk, sørg for, at prøven er i PCR-opløsningen og ikke mod rørvæggen.Hvis direkte PCR bruges til at amplificere lange fragmenter og komplekse prøver, kan brug af en prøve med en mindre diameter (0,5 – 1 mm) som skabelon hjælpe med at opnå bedre resultater.

Slibelysemetode:Det anbefales at bruge unge blade.Tag et lille stykke blad (ca. 1 – 3 mm i diameter), anbring det i 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, og mal det så meget som muligt (dette trin kan gøres ved at klemme bladet med en 100 μl pipettespids at mose prøven).Hvis der anvendes større mængder bladvæv (ikke over 7 mm), øges volumen af ​​fortyndingsbuffer til 50 μl.Efter at bladene er malet, skal opløsningen se grøn ud.Efter en kort centrifugering tilsættes 1 μl af supernatanten til PCR-systemet som reaktionsskabelonc.

Termisk lysismetode:Det anbefales at bruge unge blade.Tag et lille stykke blad (ca. 1 – 3 mm i diameter), læg det i 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, og opvarm det ved 95°C i 5 – 10 min.Lyseringstiden kan forlænges passende for blade, der er svære at lysere (ikke mere end 20 min).Hvis der anvendes større mængder bladvæv (ikke over 7 mm), øges volumen af ​​fortyndingsbuffer til 50 μl.Efter opvarmning, centrifuger kortvarigt, og tilsæt 1 μl supernatant til PCR-systemet som en reaktionsskabelon.

Prøvebehandling– Plantefrø

Slibelysemetode:Brug en skalpel til at skære frø med en diameter på 5 mm, tilsæt dem til 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A, og mal prøven med en pipettespids eller andet værktøj.Vortex kort og lad stå ved stuetemperatur i 3 – 5 min.Sørg for, at frøprøven er nedsænket i fortyndingsbufferen.Efter en kort centrifugering tilsættes 1 μl af supernatanten til PCR-systemet som reaktionsskabelon.

Termisk lysismetode:Brug en skalpel til at skære frø med en diameter på 5 mm, tilsæt dem til 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A, og opvarm ved 95°C i 5 – 10 min.Lyseringstiden kan forlænges passende for blade, der er svære at lysere (ikke mere end 30 min).Efter opvarmning, centrifuger kortvarigt, og tilsæt 1 μl supernatant til PCR-systemet som en reaktionsskabelon.

en.Sakse eller andre værktøjer kan også bruges til at skære prøver af passende størrelse;hvis stansen eller saksen genbruges, skal de rengøres med 2 % natriumhypochloritopløsning før hver brug for at forhindre krydskontaminering mellem prøverne.

b.Sørg for, at Plant Direct Lysis Buffer er helt smeltet før brug.Hvis bufferen er tyktflydende eller har bundfald, kan den opvarmes til 37 ℃ for at smelte den fuldstændigt før brug.

c.Skabelonvolumenet i reaktionssystemet kan justeres passende i overensstemmelse med forskellen i volumenet af plantemateriale og tilsat fortyndingsmiddel.

Plant direkte lysisbuffer

Plant Direct Lysis Buffer A indeholdt i dette produkt er blevet strengt optimeret til at frigive genomet fra de fleste plantevæv og er velegnet til korttidsopbevaring af rå planter ved 4 ℃.Hvis prøven skal opbevares i længere tid (f.eks. 1 – 2 måneder), anbefales det at overføre supernatanten til et nyt EP-rør og opbevare det ved -20℃.For at opbevare prøverne mere stabilt, tilsæt et lige så stort volumen Plant Direct Lysis Buffer B til den overførte supernatant, bland godt og opbevar ved -20 ℃.Den stabile opbevaringstid varierer med planteprøver og tilstande.

Reaktionssystem

en.Den indeholder Mg²⁺ved en slutkoncentration på 2 mM.

b.Det anbefales at bruge en slutkoncentration på 0,4μM for hver primer.Overdreven brug af primere vil føre til øget uspecifik amplifikation.

c.Mængden af ​​anvendt prøve kan justeres i henhold til den faktiske situation.Mængden, der bruges i en enkelt reaktion af rå lyseret prøve, kan justeres mellem 2% - 20% af reaktionens samlede volumen.Brug af for mange prøver kan forårsage amplifikationsfejl.

Reaktionsprogram

en.Indledende denaturering (98 ℃, 5 min) fremmer lysis af plantevæv og frigiver genomisk DNA, der kan bruges til PCR-amplifikation.Forkort ikke tiden eller sænk temperaturen.

b.Det anbefales at indstille den lig med primerens Tm-værdi eller 2 ~ 4℃ højere end Tm-værdien.Den direkte amplifikations-DNA-polymerase, der anvendes i dette produkt, er forskellig fra konventionel Taq DNA-polymerase og har særlige krav til reaktions-annealingstemperaturen; brugen af ​​høj annealingstemperatur kan effektivt reducere uspecifik amplifikation og forbedre amplifikationseffektiviteten.For komplekse skabeloner kan den effektive forstærkning opnås ved at justere annealingstemperaturen og forlænge forlængelsestiden.

c.Hvis længden af ​​amplifikationsproduktet er ≤1 kb, sættes forlængelsestiden til 30 sek/kb;hvis længden af ​​amplifikationsproduktet er >1 kb, sættes forlængelsestiden til 60 sek/kb.

d.For komplekse prøver eller prøver med lavt amplifikationsudbytte kan antallet af cyklusser passende øges til 40-50 cyklusser.

Ansøgninger

Den er anvendelig til direkte amplifikation af plantevæv og high-throughput screening af planteprøver, der ikke indeholder polysaccharider og polyphenoler.

Noter

Kun til forskningsbrug.Ikke til brug i diagnostiske procedurer.

1. Til rå planteamplifikation eller direkte amplifikation anbefales det at bruge oprenset genomisk DNA som en positiv kontrol før forsøget startes for at sikre, at systemet, primerne og operationer er korrekte.

2. Den direkte amplifikations-DNA-polymerase, der anvendes i dette sæt, har en stærk korrektur-aktivitet.Hvis TA-kloning skal udføres, anbefales det at rense DNA'et, før adeninet tilsættes.

3. Grundlæggende designvejledning:

en.Det anbefales, at den sidste base i 3′-enden af ​​primeren er G eller C.

b.Konsekutive mismatches bør undgås i de sidste 8 baser i 3′-enden af ​​primeren.c.Undgå hårnålestrukturer i 3′-enden af ​​primeren.

d.Forskelle i Tm-værdien for den fremadgående primer og den omvendte primer bør ikke være mere end 1 ℃, og Tm-værdien bør justeres til 60 ~ 72 ℃ (Primer Premier 5 anbefales til at beregne Tm-værdien).

e.Ekstra yderligere primersekvenser, der ikke matches med skabelonen, bør ikke inkluderes ved beregning af primerens Tm-værdi.

f.Det anbefales, at GC-indholdet i primeren er 40% -60%.

g.Den samlede fordeling af A, G, C og T i primeren skal være så jævn som muligt.Undgå at bruge områder med højt GC- eller AT-indhold.

h.Undgå tilstedeværelsen af ​​komplementære sekvenser på 5 eller flere baser enten i primeren eller mellem to primere og undgå tilstedeværelsen af ​​komplementære sekvenser på 3 eller flere baser i 3'-enden af ​​to primere.

jeg.Brug NCBI BLAST-funktionen til at kontrollere specificiteten af ​​primeren for at forhindre uspecifik amplifikation.