Mus Genotyping Kit
Kat. nr.: HCR2021A
Dette produkt er et kit designet til hurtig identifikation af musegenotyper, inklusive rå DNA-ekstraktion og PCR-amplifikationssystem.Produktet kan anvendes til PCR-amplifikation direkte fra musehale, øre, tå og andet væv efter simpel spaltning med Lysis Buffer og Proteinase k.Ingen fordøjelse natten over, phenol-chloroform-ekstraktion eller søjleoprensning, hvilket er enkelt og forkorter den tidskrævende eksperimenter.Produktet er velegnet til amplifikation af målfragmenter op til 2 kb og multiplekse PCR-reaktioner med op til 3 par primere.2×Mouse Tissue Direct PCR Mix indeholder genetisk manipuleret DNA-polymerase, Mg2+, dNTP'er og et optimeret buffersystem til at give høj amplifikationseffektivitet og inhibitortolerance, så PCR-reaktioner kan udføres ved at tilføje template og primere og rehydrere produktet til 1×.PCR-produktet amplificeret med dette produkt har en fremtrædende "A"-base i 3'-enden og kan anvendes direkte til TA-kloning efter oprensning.
Komponenter
| Komponent | Størrelse |
| 2×Muse Tissue Direct PCR Mix | 5×1,0 ml |
| Lysis buffer | 2×20 ml |
| Proteinase K | 800 μL |
Opbevaringsbetingelser
Produkter skal opbevares ved -25~-15 ℃ i 2 år.Efter optøning kan Lysis Buffer opbevares ved 2~8 ℃ til kortvarig flergangsbrug og blandes godt under brug.
Ansøgning
Dette produkt er velegnet til muse-knockout-analyse, transgen påvisning, genotypebestemmelse og så videre.
Funktioner
1.Enkel betjening: ingen grund til at ekstrahere genomisk DNA;
2.Bred anvendelse: velegnet til direkte amplifikation af forskellige musevæv.
Instruktioner
1.Frigivelse af genomisk DNA
1) Fremstilling af lysat
Vævslysat fremstilles i overensstemmelse med antallet af museprøver, der skal lyseres (vævslysat skal fremstilles på stedet i henhold til doseringen og blandes grundigt til brug), og den nødvendige andel af reagenser til en enkelt prøve er som følger:
| Komponenter | Volumen (μL) |
| Proteinase K | 4 |
| Lysis buffer | 200 |
2) Prøveforberedelse og lyse
Anbefalet brug af væv
| TypeVæv | Anbefalet volumen |
| Musehale | 1-3 mm |
| Mus øre | 2-5 mm |
| Musetå | 1-2 stk |
Tag en passende mængde musevævsprøver i rene centrifugerør, tilsæt 200 μL frisk vævslysat til hvert centrifugerør, vortex og ryst, inkubér derefter ved 55 ℃ i 30 minutter og opvarm derefter ved 98 ℃ i 3 minutter.
3) Centrifugering
Ryst lysatet godt og centrifuger ved 12.000 rpm i 5 minutter.Supernatanten kan anvendes som skabelon til PCR-amplifikation.Hvis skabelonen er nødvendig til opbevaring, overføres supernatanten til et andet sterilt centrifugerør og opbevares ved -20 ℃ i 2 uger.
2.PCR-amplifikation
Fjern 2×Mouse Tissue Direct PCR-blandingen fra -20 ℃ og optø på is, bland på hovedet og klargør PCR-reaktionssystemet i henhold til følgende tabel (brug på is):
| Komponenter | 25μLSystem | 50μLSystem | Endelig koncentration |
| 2×Muse Tissue Direct PCR Mix | 12,5 μL | 25 μL | 1× |
| Primer 1 (10μM) | 1,0 μL | 2,0 μL | 0,4 μM |
| Primer 2 (10μM) | 1,0 μL | 2,0 μL | 0,4 μM |
| Spaltningsprodukta | Efter behov | Efter behov |
|
| ddH2O | Op til 25μL | Op til 50μL |
|
Bemærk:
a) Den tilsatte mængde bør ikke overstige 1/10 af systemet, og hvis der tilsættes for meget, kan PCR-amplifikation hæmmes.
Anbefalede PCR-betingelser
| Cyklus trin | Midlertidig. | Tid | Cykler |
| Indledende denaturering | 94℃ | 5 min | 1 |
| Denaturering | 94℃ | 30 sek | 35-40 |
| Udglødninga | Tm+3~5℃ | 30 sek | |
| Udvidelse | 72℃ | 30 sek/kb | |
| Endelig forlængelse | 72℃ | 5 min | 1 |
| - | 4℃ | Holde | - |
Bemærk:
a) Udglødningstemperatur: Med reference til primerens Tm-værdi anbefales det at indstille annealingstemperaturen til den mindste Tm-værdi for primeren +3~5℃.
Almindelige problemer og løsninger
1.Ingen målrettede strimler
1) Overdreven lyseringsprodukt.Vælg den mest passende mængde skabelon, normalt ikke mere end 1/10 af systemet;
2) For stor prøvestørrelse.Fortynd lysatet 10 gange og amplificer derefter, eller reducer prøvestørrelsen og genlys;
3) Vævsprøver er ikke friske.Det anbefales at bruge friske vævsprøver;
4) Dårlig primerkvalitet.Brug genomisk DNA til amplifikation for at verificere primerkvaliteten og optimere primerdesignet.
2.Ikke-specifik amplifikation
1) Udglødningstemperaturen er for lav, og cyklustallet er for højt.Forøg udglødningstemperaturen og reducer antallet af cyklusser;
2) Skabelonkoncentrationen er for høj.Reducer mængden af skabelon eller fortynd skabelonen 10 gange efter amplifikation;
3) Dårlig primerspecificitet.Optimer primerdesignet.
Noter
1.For at undgå krydskontaminering mellem prøver bør der forberedes flere prøvetagningsværktøjer, og overfladen af værktøjerne kan rengøres med 2 % natriumhypochloritopløsning eller nukleinsyrerens efter hver prøvetagning, hvis gentagen brug er påkrævet.
2.Det anbefales at bruge friskt musevæv, og prøveudtagningsvolumenet bør ikke være for stort for at undgå at påvirke amplifikationsresultaterne.
3.Lysisbuffer bør undgå hyppig frysning-optøning og kan opbevares ved 2~8 ℃ til kortvarig flergangsbrug.Hvis det opbevares ved lav temperatur, kan der forekomme nedbør og skal være helt opløst før brug.
4.PCR Mix bør undgå hyppig frysning-optøning og kan opbevares ved 4 ℃ til kortvarig gentagen brug.
5.Dette produkt er kun til videnskabelig eksperimentel forskning og bør ikke bruges til klinisk diagnose eller behandling.
