M-MLV omvendt transkriptase
RevScript Revers transkriptase opnås ved genteknologi.Det har højere cDNA-synteseevne, termisk stabilitet og reaktionstemperaturgrænse (op til 60°C).Det syntetiserede cDNA-produkt er op til 10 kb.Det øger skabelonernes affinitet og er velegnet til omvendt transkription af RNA-skabeloner med kompleks sekundær struktur eller gener med lav kopi.
Komponenter
| Komponent | HC2003B (10.000 U) | HC2003B (5*10.000U) | HC2003B (200.000 U) |
| RevScript omvendt transkriptase (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 ml |
| 5 × RevScript-buffer | 250 μL | 1,25 ml | 5 ml |
Opbevaringstilstand
Dette produkt skal opbevares ved -25°C~-15°C i 2 år.
Enhedsdefinition
En enhed inkorporerer 1 nmol dTTP i syreuopløseligt materiale på 10 minutter ved 37°C ved at bruge Oligo(dT) som primere.
Reaktionsopsætning
1.Denaturering af RNA-skabelon (Dette trin er valgfrit, denaturering af RNA-skabelon hjælper med at åbne de sekundære strukturer, hvilket vil forbedre udbyttet af den første strengs cDNA.)
| Komponenter | Volumen (μL) |
| RNase fri ddH2O | Til 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) eller Random Primer (50 μmol/L) Eller genspecifikke primere (2 μmol/L) | 1 |
| eller 1 | |
| eller 1 | |
| RNA skabelon | X a |
Bemærkninger:
1) a: Total RNA: 1-5 ug eller mRNA: 1-500 ng
2) Inkubering ved 65°C i 5 minutter, derefter overførsel på is med det samme til afkøling i 2 minutter.Kort centrifugering for at opsamle reaktionsvæske, tilsæt revers transkriptionsreaktionsopløsningen som vist i følgende tabel.Pipetter forsigtigt for at blande.
1.Fremstilling af reaktionsblandingen (20 μL volumen)
| Komponenter | Volumen (μL) |
| Blanding af forrige trin | 13 |
| 5× Buffer | 4 |
| dNTP-blanding (10nmol/L) | 1 |
| Omvendt transkriptase (200 U/μL) | 1 |
| RNase-hæmmer (40 U/μL) | 1 |
1.Udfør reaktionen under følgende betingelser:
| Temperatur (°C) | Tid |
| 25 °Ca | 5 min |
| 42 °Cb | 15-30 min |
| 85 °Cc | 5 min |
Bemærkninger:
1) a.Inkubation ved 25 °C i 5 minutter er kun påkrævet for at bruge de tilfældige hexamerer.Spring dette trin over, når du bruger Oligo (dT)18eller genspecifik primer.
2) b.Den anbefalede revers transkriptionstemperatur er 42°C. For skabeloner med komplicerede sekundære strukturer eller højt GC-indhold anbefales det at hæve reaktionstemperaturen til 50-55°C.
3) c.Opvarmning ved 85°C i 5 minutter for at inaktivere revers transkriptase.
4) Produktet kan anvendes direkte i PCR- eller qPCR-reaktioner eller opbevares ved -20°C til korttidsopbevaring.Det anbefales at justere produkterne og opbevare dem ved -80°C til langtidsopbevaring.Undgå hyppig frysning-optøning.
5) Produktet er velegnet til et-trins RT-qPCR, det anbefales at tilføje 10-20 U revers transkriptase for hvert 25μL reaktionssystem, eller gradvist øge mængden af revers transkriptase i henhold til den faktiske situation.
Noter
1.Hold venligst forsøgsområdet rent;Rene handsker og masker skal bæres under drift.Alle forbrugsstoffer, der anvendes i eksperimentet, bør være RNase-fri for at forhindre RNase-kontamination.
2.Alle procedurer bør udføres på is for at forhindre RNA-nedbrydning.
3.RNA-prøver af høj kvalitet anbefales for at sikre høj effektivitet af revers transkription.
4.Dette produkt er kun til forskningsbrug.
5.Brug venligst laboratoriefrakker og engangshandsker for din sikkerhed.
