DNA-ekstraktions-minisæt
Dette sæt anvender optimeret buffersystem og silicagelsøjleoprensningsteknologi, som kan genvinde 70 bp – 20 kb DNA-fragmenter fra forskellige koncentrationer af TAE eller TBE agarosegel.DNA-adsorptionssøjle kan specielt adsorbere DNA under højsaltforhold.Derudover kan sættet direkte oprense DNA-fragmenter fra PCR-produkter, enzymatiske reaktionssystemer eller rå DNA-produkter opnået ved andre metoder, og fjerne urenheder såsom proteiner, andre organiske forbindelser, uorganiske saltioner og oligonukleotidprimere.Det kan sikre, at oprensningen kan gennemføres inden for 10-15min.Det oprensede DNA kan bruges direkte til ligering, transformation, enzymfordøjelse, in vitro transkription, PCR, sekventering, mikroinjektion osv.
Opbevaringsforhold
Opbevares ved -15 ~ -25 ℃ og transporteres ved stuetemperatur.
Komponenter
| Komponenter | (100 rxns) |
| Buffer BNP | 80 ml |
| Buffer GW | 2 × 20 ml |
| Elueringsbuffer | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
Buffer BNP:DNA bindende buffer.
Buffer GW:Vaskebuffer;tilsæt absolut ethanol med den angivne mængde på flasken før brug.
Elueringsbuffer:Eluering.
FastPure DNA Mini Columns-G:DNA-adsorptionssøjler.
Opsamlingsrør 2 ml:Opsamlingsrør til filtrat.
Forberedte materialer
1,5 ml steriliserede rør, absolut ethanol og isopropanol (når DNA-fragment ≤100 bp, tilsæt 1 volumen
isopropanol til 1 volumen gel), vandbad.
Eksperiment proces
Tilsæt 80 ml ethanol for at fortynde buffer GW som angivet på tag før brug, opbevar ved stuetemperatur.
Mekanisme
1. PCR-reaktionsopløsning
Gelekstraktionsskema: Tilsæt lige volumen Buffer GDP PCR-reaktionsopløsningsgenvindingsskema:Tilføj 5 gange volumen Buffer
2. BNP Beregn volumenet af gel (100 μl svarer til 100 mg)
Opløs gel
3. Forvarm til 50 ~ 55℃
4. Bind Vask
Tilføj 300 μL buffer BNP*
Tilsæt 700 μL buffer GW
Tilsæt 700 μL buffer GW
5. Eluer
Tilsæt 20 – 30 μL elueringsbuffer eller deioniseret vand
Bemærkninger* PCR-reaktionsvæskegenvinding uden dette trin
Gelekstraktionsprogram
1. Efter DNA-elektroforese til fraktionering af DNA-fragmenter udskæres den enkelte stribe af DNA-fragment fra agarosegelen under UV-lys.Det anbefales at bruge absorberende papir til at absorbere den tilsyneladende fugt fra gelen og minimere størrelsen af gelskiven ved at fjerne ekstra agarose som muligt.Vej gelskiven (uden mikrocentrifugerør) for at beregne dens volumen: Volumenet af 100 mg gelskive er ca. 100 μL, forudsat at densiteten er 1 g/ml.
2. Tilføj lige volumen Buffer GDP, inkuber ved 50~55 ℃ i 7-10 minutter (i henhold til gelstørrelsen justeres inkubationstiden, indtil gelen er fuldstændig opløst).Vend røret 2 gange under inkubationen.
Δ Tilsætning af 1-3 volumener Buffer GDP vil ikke påvirke effektiviteten af DNA-gendannelse.Hvis DNA-fragmentet, der skal genvindes, <100 bp, skal der tilføjes 3 volumener Buffer GDP;når gelskiven er helt opløst, tilsæt 1 volumen isopropanol og bland grundigt, fortsæt derefter til næste trin.
3. Centrifuger kort for at bringe prøven til bunden af røret, indsæt FastPure DNA Mini Columns-G i opsamlingsrørene 2 ml, overfør forsigtigt opløsningen maksimalt 700 μL én gang pr.
tid til filtreringskolonnerne, centrifuger ved 12.000 rpm (13.800 X g) i 30-60 sek.
4. Kassér filtratet og tilsæt 300 μL Buffer GDP til kolonnen, inkuber ved stuetemperatur i 1 min, centrifuger ved 12.000 rpm (13.800 X g) i 30-60 sek.
5. Kassér filtratet og tilsæt 700 μL Buffer GW (tjek om absolut ethanol er tilsat på forhånd!) til kolonnen, centrifuger ved 12.000 rpm (13.800 X g) i 30-60 sek.
Δ Tilsæt venligst Buffer GW rundt om adsorptionskolonnens væg, eller tilføj Buffer GW-bagdækslet og bland det på hovedet i 2 – 3 gange for at hjælpe helt med at skylle saltet, der klæber til rørvæggen.
6. Gentag trin 5.
Δ Skylning med Buffer GW to gange kan sikre, at saltet fjernes fuldstændigt og eliminere påvirkningen af efterfølgende eksperimenter.
7. Kassér filtratet, og centrifuger den tomme kolonne ved 12.000 rpm (13.800 X g) i 2 min.
8. Indsæt kolonnen i et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør, tilsæt 20 - 30 μL elueringsbuffer til midten af kolonnemembranen, inkuber i 2 minutter, og centrifuger derefter ved 12.000 rpm (13.800 X g) i 1 min.Kassér kolonnen, opbevar det opnåede DNA ved -20°C.
Δ Overførsel af supernatanten fra trin 8 til kolonnen for at eluere igen og forvarmning af elueringsbufferen til 55 (når DNA-fragmentet >3 kb) kan være nyttigt til at øge genvindingseffektiviteten.
PCR-produktgendannelsesprogram
Denne protokol er anvendelig til at oprense DNA-fragmenter fra PCR-produkter, enzymatiske reaktionssystem og andre rå DNA-produkter (herunder genetisk DNA).Denne opløsning kan effektivt fjerne forskellige nukleotider, primere, primer-dimere, saltmolekyler, enzymer og andre urenheder.
1. Centrifuger kort PCR-produkter, enzymatisk reaktionsopløsning og andre DNA-råprodukter.Estimer deres volumen med pipette og overfør til et steriliseret 1,5 ml eller 2 ml rør.Tilføj ddH2O indtil volumen op til 100 μL;mens for genomisk DNA med høj koncentration vil fortynding til 300 μL med ddH2O hjælpe med at forbedre genvindingseffektiviteten.
2. Tilsæt 5 volumener Buffer GDP, bland grundigt ved at vende eller vortex.Hvis DNA-fragmentet af interesse >100 bp, skal der tilføjes yderligere 1,5 volumener (prøver + Buffer GDP) ethanol.
3. Sæt kolonnen tilbage i opsamlingsrøret, overfør blandingen til kolonnen, centrifuger ved 12.000 rpm (13.800 ×g) i 30 – 60 sek.Hvis volumenet af den blandede opløsning er >700 µL, sættes adsorptionssøjlen tilbage i opsamlingsrøret, overfør den resterende opløsning til adsorptionssøjlen og centrifuger ved 12.000 rpm (13.800 × g) i 30 – 60 sek.
4. Den næste ydelse refererer til trin 5 – 8 i 08- 1/Gelekstraktionsprogrammet.
Ansøgninger
Forskellige koncentrationer af TAE eller TBE agarosegel;PCR-produkter, enzymatiske reaktionssystemer eller andre rå DNA-produkter opnået ved forskellige metoder.Genvundne fragmenter varierede fra70 bp -20 kb.
Noter
Kun til forskningsbrug.Ikke til brug i diagnostiske procedurer.
1. Tilsæt 80 ml ethanol for at fortynde buffer GW som angivet på tag før brug, opbevar ved stuetemperatur.
2. Hvis Buffer BNP er let at udfælde under lavtemperaturlagring, kan den placeres ved stuetemperatur i en periode før brug.Hvis det er nødvendigt, kan det forvarmes i et 37℃ vandbad, indtil bundfaldet er helt opløst, og derefter kan det bruges efter blanding.
3. Indstil vandbadstemperaturen til 50 ~55℃ på forhånd.
4. I 08-1/Gel-ekstraktionsprogrammet trin 1 vil minimering af størrelsen af gelskiven reducere opløsningstiden betydeligt og øge genvindingseffektiviteten (lineariseret DNA er let at hydrolysere, når det konstant eksponeres ved høj temperatur).Udsæt ikke DNA-gelen for UV i længere tid, da ultraviolet lys kan forårsage DNA-skader.
5. Opløs gelen fuldstændigt i 08- 1/Gelekstraktionsprogram trin 2, ellers vil DNA-genvindingseffektiviteten blive alvorligt påvirket.
6. Forvarm elueringsbuffer eller ddH2O til 55 ℃, hvilket er nyttigt til at forbedre DNA-elueringseffektiviteten.Det anbefales at opbevare DNA i eluent af 2,5 mM Tris-HCl, pH 7,0 – 8,5.
