EndoFree Plasmid Maxi Kit

Opbevaringsforhold

RNaseA bør opbevares ved -30 ~ -15 ℃ og transporteres ved ≤0 ℃.

Endotoxin Scavenger kan opbevares ved 2 ~ 8 ℃ i en måned, opbevares ved -30 ~ -15 ℃ til langtidsopbevaringog transporteres ved ≤0℃.

Andre komponenter skal opbevares ved stuetemperatur (15 ~ 25 ℃) og transporteres ved stuetemperatur.

Komponenter

RNaseA:10 mg/ml, bruges til at fjerne RNA.

Buffer P1:bakteriesuspensionsbuffer, tilsæt RNaseA til buffer P1 før første brug.

Buffer P2:bakteriel lysisbuffer (indeholdende SDS/NaOH).

Buffer P4:neutraliserende buffer.

Endotoksin scavenger:fjerner effektivt endotoksin fra det rå plasmidekstrakt.

Buffer PW:vaskebuffer, tilsæt den foreskrevne mængde ethanol før første brug.

Buffer TB:elueringsbuffer.

FastPure DNA Maxi-søjler:plasmid DNA adsorptionssøjler.

Opsamlingsrør 50 ml:filtratopsamlingsrør.

Endotoksinfri indsamlingsrør:plasmid DNA-opsamlingsrør.

Forberedte materialer

Absolut ethanol, isopropanol, 50 ml rundbundede centrifugerør og 50 ml endotoksinfricentrifugerør.

Ansøgninger

Dette produkt er velegnet til storskalaekstraktion af plasmider fra 150 - 300 ml bakterieopløsningdyrket natten over.

Eksperiment proces

1. Tag 150 – 200 ml (ikke mere end 300 ml) bakterieopløsning dyrket natten over og centrifuger kl.ca. 11.000 rpm (12.000 × g) i 1 – 2 min.Kassér supernatanten og opsaml bakterier.

Δ Når der opsamles mere end 50 ml bakterieopløsning, kan bakterierne opsamles ved tilsætning af bakterieopløsning, centrifugering, kassering af supernatanten og andre trin i det samme 50 ml rør for

flere gange.

2. Tilsæt 7,5 ml buffer P1 (kontroller venligst, om RNaseA er blevet tilføjet til buffer P1) til centrifugenrør indeholdende bakterier og bland grundigt ved vortex eller pipettering.

Δ Den fuldstændige resuspension af bakterier i dette trin er afgørende for at give, og der bør ikke være nogen bakterieklumper efter resuspension.Hvis der er bakterieklumper, som ikke er grundigt blandet, vil det påvirke lyseringen, hvilket resulterer i lavt udbytte og renhed.Hvis OD600 for bakterieopløsning er 0,65, anbefales det at bruge 7,5 ml Buffer P1, når der ekstraheres fra 150 ml bakterieopløsning;når OD600 er 0,75, skal der anvendes 8 ml Buffer P1, og volumenerne af Buffer P2 og P4 skal ændres i overensstemmelse hermed.Hvis volumen af ​​bakterieopløsningen øges til 200 ml, anbefales det atvolumen af ​​buffere P1, P2 og P4 øges proportionalt.

3. Tilsæt 7,5 ml Buffer P2 til bakteriesuspensionen fra trin 2 og bland forsigtigt op og ned i 6 – 8gange og inkuber ved stuetemperatur i 4 – 5 min.

Δ Vend forsigtigt for at blande grundigt.Vortexing vil forårsage den genomiske DNA-fragmentering, hvilket resulterer i genomiske DNA-fragmenter i det ekstraherede plasmid.På dette tidspunkt bliver opløsningen tyktflydende og gennemskinnelig, hvilket viser, at bakterierne er blevet fuldt lyseret.Varigheden bør ikke overstige 5 minutter for at undgå ødelæggelse af plasmiderne.Hvis opløsningen ikke er klar, kan der være for mange bakterier, der resulterer iufuldstændig lyse, så mængden af ​​bakterier bør reduceres passende.

4. Tilsæt 7,5 ml buffer P4 til bakteriesuspensionen fra trin 3 og vend straks forsigtigt 6 – 8 gange for at lade opløsningen neutralisere buffer P2 fuldstændigt.På dette tidspunkt skulle hvidt flokkuleret bundfald fremkomme.Centrifuger ved mere end ca. 11.000 rpm (12.000 × g) i 10 – 15 minutter, afpippet forsigtigt supernatanten i et nyt 50 ml rundbundet centrifugerør (selvforberedt), og undgåaspirer det flydende hvide bundfald.

Δ Tilsæt buffer P4 og vend straks for at blande godt.Lad røret stå, indtil det hvide bundfald er fordelt jævnt i opløsningen for at forhindre produktion af lokal nedbør, som kan påvirke neutraliseringen.Hvis der ikke er noget ensartet hvidt flokkulent bundfald før centrifugering, og supernatanten ikke er klar efter centrifugering, kan røretcentrifugeres i yderligere 5 min.

5. Tilsæt 0,1 gange volumenet (10 % af supernatantvolumenet, ca. 2,2 ml) Endotoxin Scavenger til supernatanten fra trin 4 og vend for at blande.Anbring opløsningen i et isbad eller sæt den i knust is (eller køleskabsfryser) i 5 minutter, indtil opløsningen skifter fra grumset til klar og gennemsigtig (eller stadiglidt grumset), og bland lejlighedsvis flere gange.

Δ Efter at Endotoxin Scavenger er tilsat til supernatanten, vil supernatanten blive uklar, mensupernatanten bør blive klar (eller let uklar) efter afkøling i isbadet.

6. Efter at supernatanten er anbragt ved stuetemperatur (>25℃) i 10 – 15 minutter, vil den blive uklar somdens temperatur stiger til stuetemperatur.Derefter skal supernatanten vendes for at blandes.

Δ Hvis stuetemperaturen er lavere, eller du ønsker at reducere ekstraktionstiden, kan supernatanten inkuberes i et 37 ~ 42 ℃ vandbad i 5 – 10 minutter, og det næste trin kan udføres efter supernatantenbliver grumset.

7. Centrifuger supernatanten ved ca. 11.000 rpm (12.000 × g) i 10 minutter ved stuetemperatur (temperaturen skal være >25 ℃) for at adskille fasen.Den øvre vandige fase indeholder DNA'et, mens det nedre blå oliefaselag indeholder endotoksin og andre urenheder.OverførDNA-holdig vandig fase til et nyt rør ogkassér det olieagtige lag.

Δ Temperaturen under centrifugering skal være over 25℃, da effektiv faseadskillelse ikke gør detopstår, hvis temperaturen er for lav.

Δ Hvis faseadskillelsen ikke er effektiv, kan centrifugeringstemperaturen justeres til 30 ℃ ogcentrifugeringstiden kan øges til 15 min.

Δ Sut ikke det blå olieagtige lag, da det indeholder endotoksin og andre urenheder.

Mekanisme

Resuspension Lysis Neutralisation

◇ Tilsæt 7,5 ml buffer P1

◇ Tilsæt 7,5 ml buffer P2

◇ Tilsæt 7,5 ml buffer P4

Endotoksin fjernelse

◇Tilsæt 0,1 gange supernatantvolumenet af Endotoxin Scavenger

Indbinding og vask

◇ Tilsæt 0,5 gange mængden af ​​isopropanol

◇ Tilsæt 10 ml buffer PW