5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Kat. nr.: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) er en meget stabil et-rørs probebaseret blanding, der er velegnet til et-trins revers transkription og kvantitativ PCR (qRT-PCR).Det understøtter forblanding af primere og prober og forbliver stabilt efter lang tids opbevaring ved lav temperatur.Prøven, der skal testes, kan tilføjes direkte under brug, uden yderligere røråbning/pipettering.Dette produkt indeholder komponenter, f.eks. hot-start DNA polymerase, M-MLV, varmelabil uracil DNA glycosylase (TS-UNG), RNase inhibitor, MgCl2, dNTP'er (med dUTP i stedet for dTTP) og stabilisatorer.Med den genetisk modificerede hurtige amplifikation revers transkriptase og DNA-polymerase er det muligt at fuldføre PCR-amplifikationen inden for 20-40 minutter.Dette reagens bruger speciel buffer til qPCR med blandede enzymer af anti-inhiberende amplifikationsenzym og UNG-enzym.Derfor kan det opnå god amplifikation af målgener og forhindre falsk amplifikation forårsaget af PCR-rest- og aerosolforurening.Dette reagens er kompatibelt med de fleste fluorescens kvantitative PCR-instrumenter fra producenter som Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad og Roche.
Komponent
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Opbevaringsbetingelser
Alle komponenter skal opbevares ved -20 ℃ til langtidsopbevaring og 4 ℃ i op til 3 måneder.Bland venligst grundigt efter optøning og centrifuger før brug.Undgå hyppig frysning-optøning.
Forberedelse af qRT-PCR-reaktionssystem
| Komponenter | 25μLSystem | 50μLSystem | Endelig koncentration |
| 5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5 μL | 10 μL | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1 μL | 2μL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mixa | 1 μL | 2μL | 1× |
| Skabelon RNAb | – | – | – |
| ddH2O | Op til 25μL | Op til 50μL | – |
1) a. Den endelige koncentration af primer er normalt 0,2μM.For bedre resultater kan primerkoncentrationen optimeres inden for området 0,2-1μM.Generelt kan probekoncentrationen optimeres inden for området 0,1-0,3μM.
2) b. Ved brug af en hurtig PCR-procedure kan en forøgelse af koncentrationen af primere og prober resultere i bedre amplifikationsresultater, og deres forhold bør optimeres i overensstemmelse hermed.
3) Forskellige typer prøver indeholder forskellige typer og indhold af inhibitor og kopinummer af målgen.Prøvevolumenet bør tages i betragtning ud fra den faktiske tilstand.Lav en fortynding af prøven med nukleasefrit vand eller TE-buffer, hvis det er nødvendigt.
Reaktion Cbetingelser
| Almindelig PCR-procedure | Hurtig PCR-procedure | ||||||
| Procedure | Midlertidig. | Tid | Cyklus | Procedure | Midlertidig. | Tid | Cyklus |
| Omvendt transskription | 50 ℃ | 10-20 min | 1 | Omvendt transskription | 50 ℃ | 5 min | 1 |
| Polymerase Aktivering | 95℃ | 1-5 min | 1 | Polymerase Aktivering | 95℃ | 30'erne | 1 |
| Denaturering | 95℃ | 10-20 s | 40-50 | Denaturering | 95℃ | 1-3 sek | 40-50 |
| Udglødning og Udvidelse | 56-64℃ | 20-60'erne | Udglødning og Udvidelse | 56-64℃ | 3-20s | ||
Kvalitetskontrol
1.Funktionsdetektion: sensitivitet, specificitet og repeterbarhed af qPCR.
2.Ingen eksogen nukleaseaktivitet: ingen exogen endonuklease og exonukleaseforurening.
Noter
1.Amplifikationshastigheden for hurtig DNA-polymerase er ikke mindre end 1 kb/10s.Forskellige PCR-instrumenter har forskellige opvarmnings- og afkølingshastigheder, temperaturstyringstilstande og termisk ledningsevne, og derfor er optimering af din primer/probe-koncentration og kørselsmetode i kombination med dit specifikke hurtige PCR-instrument afgørende.
2.Dette produkt har bred anvendelighed, og det er velegnet til højfølsom molekylær diagnose.Tre-trins PCR-metode anbefales til primere med lav annealingstemperatur eller til amplifikation af lange fragmenter over 200 bp.
3.Da forskellige amplikoner har forskellig udnyttelseseffektivitet af dUTP og forskellig følsomhed over for UNG, bør reagenserne optimeres, hvis detektionsfølsomheden falder ved brug af UNG-system.Kontakt os venligst for teknisk support, hvis det er nødvendigt.
4.For at undgå amplifikation af overførte PCR-produkter kræves dedikeret forsøgsområde og pipette til amplifikation.Arbejd med handsker og skift ofte, og åbn ikke PCR-røret efter amplifikation.
