Proteinase K NGS (pulver)
Kat. nr.: HC4507A
NGS Protease K er en stabil serinprotease med høj enzymaktivitet og bred substratspecificitet. Enzymet nedbryder fortrinsvis esterbindinger og peptidbindinger ved siden af C-terminalen af hydrofobe aminosyrer, svovlholdige aminosyrer og aromatiske aminosyrer.Så det bruges ofte til at nedbryde proteiner til korte peptider.NGS Protease K er en typisk serinprotease med Asp39-Hans69- Ser224katalytisk triade som er unik for serinproteaser, og det katalytiske center er omgivet af tow Ca2+bindingssteder til stabilisering, opretholdelse af høj enzymaktivitet under en bredere række af betingelser.
Specifikation
| Udseende | Hvidt til råhvidt amorft pulver, lyofiliseret |
| Specifik aktivitet | ≥40U/mg fast stof |
| DNase | Ingen fundet |
| RNase | Ingen fundet |
| Biobyrde | ≤50 CFU/g fast stof |
| Nukleinsyrerest | <5pg/mg fast stof |
Ejendomme
| Kilde | Tritirachium album |
| EF-nummer | 3.4.21.64(Rekombinant fra Tritirachium album) |
| Molekylær vægt | 29 kDa (SDS-SIDE) |
| Isoelektrisk punkt | 7.81 Fig.1 |
| Optimal pH | 7.0-12.0 (Alle udfører høj aktivitet) Fig.2 |
| Optimal temperatur | 65℃ Fig.3 |
| pH-stabilitet | pH 4,5-12,5 (25℃,16 timer) Fig.4 |
| Termisk stabilitet | Under 50 ℃ (pH 8,0, 30 min.) Fig.5 |
| Opbevaringsstabilitet | Opbevares ved 25 ℃ i 12 måneder Fig.6 |
| Aktivatorer | SDS, urinstof |
| Inhibitorer | diisopropylfluorphosphat;benzylsulfonylfluorid |
Opbevaringsbetingelser
Opbevar det lyofiliserede pulver ved -25~-15 ℃ i lang tid væk fra lys;Efter opløsning, alikvoter i passende volumen til korttidsopbevaring ved 2-8 ℃ væk fra lys eller langtidsopbevaring ved -25~-15 ℃ væk fra lys.
Forholdsregler
Bær beskyttelseshandsker og beskyttelsesbriller ved brug eller vejning, og hold godt ventileret efter brug.Dette produkt kan forårsage allergisk hudreaktion og alvorlig øjenirritation.Hvis det indåndes, kan det forårsage allergi- eller astmasymptomer eller dyspnø.Kan forårsage irritation af luftvejene.
Enhedsdefinition
En enhed af NGS Protease K er defineret som den mængde enzym, der kræves for at hydrolysere kasein til 1 μmol L-tyrosin under standardbestemmelsesbetingelser.
Klargøring af reagenser
| Reagens | Fabrikant | Katalog |
| Kasein tekniskfra kvægmælk | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Trichloreddikesyre | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Natriumacetat | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Eddikesyre | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Natriumcarbonat | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Folin-phenol | Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tyrosin | Sigma | 93829 |
Reagens I:
Substrat: 1 % kasein fra bovin mælkeopløsning: opløs 1 g bovin mælkekasein i 50 ml 0,1 M natriumphosphatopløsning, pH 8,0, opvarm i vandbad ved 65-70 °C i 15 minutter, omrør og opløs, afkøl med vand, justeret med natriumhydroxid til pH 8,0 og fortynd til 100 ml.
Reagens II:
TCA-opløsning: 0,1M trichloreddikesyre, 0,2M natriumacetat og 0,3M eddikesyre (vej 1,64g trichloreddikesyre + 1,64g natriumacetat + 1,724mL eddikesyre successivt, tilsæt 50mL deioniseret vand, juster med HCl til pH 4. 100 ml).
Reagens III:
0,4 m natriumcarbonatopløsning (vej 4,24 g vandfrit natriumcarbonat og opløs i 100 ml vand)
Reagens IV:
Folin phenol reagens: fortynd 5 gange med deioniseret vand.
Reagens V:
Enzymfortynder: 0,1 M natriumphosphatopløsning, pH 8,0.
Reagens VI:
L-tyrosin standardopløsning: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tyrosin opløst med 0,2 M HCI.
Procedure
1. Tænd for UV-Vis spektrofotometeret og vælg fotometrisk måling.
2. Indstil bølgelængden til 660nm.
3. Tænd for vandbadet, indstil temperaturen til 37℃, sørg for, at temperaturen er uændret i 3-5 minutter.
4. Forvarm 0,5 mL substrat i et 2 mL centrifugerør ved 37 ℃ vandbad i 10 minutter.
5. Ekstraher 0,5 ml fortyndet enzymopløsning i det forvarmede centrifugerør i 10 minutter.Indstil enzymfortynder som blank gruppe.
6. Tilsæt 1,0 mL TCA-reagens umiddelbart efter reaktionen.Bland godt og inkuber i vandbad i 30 minutter.
7. Centrifuger reaktionsopløsning.
8. Tilføj følgende komponenter i den angivne rækkefølge.
| Reagens | Bind |
| Supernatant | 0,5 ml |
| 0,4 M natriumcarbonat | 2,5 ml |
| Folin phenol reagens | 0,5 ml |
9. Bland godt før inkubering i vandbad ved 37 ℃ i 30 minutter.
10. OD660blev bestemt som OD1;blank kontrolgruppe: Enzymfortynder bruges til at erstatte enzymopløsning for at bestemme OD660som OD2ΔOD=OD1-OD2.
11. L-tyrosin standardkurve: 0,5 ml forskellig koncentration af L-tyrosinopløsning, 2,5 ml 0,4 M natriumcarbonat, 0,5 ml Folin phenol reagens i 5 ml centrifugerør, inkuber i 37 ℃ i 30 minutter, påvis for OD660for forskellige koncentrationer af L-tyrosin, opnåede derefter standardkurven Y=kX+b, hvor Y er L-tyrosinkoncentrationen, X er OD600.
Beregning
2: Total volumen af reaktionsopløsning (ml)
0,5: Volumen af enzymopløsning (ml)
0,5: Reaktionsvæskevolumen brugt til kromogenbestemmelse (mL)
10: Reaktionstid (min)
Df: Fortynding multipel
C: Enzymkoncentration (mg/ml)
Figurer
Fig. 1 DNA-rest
| Prøve | Ave C4 | Nukleinsyre Gendannelse (pg/mg) | Genopretning(%) | Total Nucleic Syre ( pg/mg) |
| PRK | 24,66 | 2.23 | 83 % | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126,728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| RNA-fri H2O | Ubestemt | — | — | — |
Fig.2 Optimal pH
Fig.3 Optimal temperatur
Fig.4 pH-stabilitet
Fig.5 Termisk stabilitet
Fig.6 Opbevaringsstabilitet ved 25℃
