RNAse-hæmmer
Murin RNase-inhibitor er en rekombinant murin RNase-inhibitor udtrykt og oprenset fra E.coli.Det binder til RNase A, B eller C i et forhold på 1:1 gennem ikke-kovalent binding og hæmmer derved aktiviteten af de tre enzymer og beskytter RNA mod nedbrydning.Det er dog ikke effektivt mod RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H eller RNase fra Aspergillus.Murin RNase-hæmmer blev testet med RT-PCR, RT-qPCR og IVT mRNA og var kompatibel med forskellige kommercielle reverse transkriptaser, DNA-polymeraser og RNA-polymeraser.
Sammenlignet med humane RNase-hæmmere indeholder murin RNase-hæmmer ikke to cysteiner, der er meget følsomme over for oxidation, som forårsager inaktivering af inhibitoren.Det gør det stabilt ved lave koncentrationer af DTT (mindre end 1 mM).Denne funktion gør den velegnet til brug i reaktioner, hvor høje koncentrationer af DTT er negativ for reaktionen (f.eks. Real-time RT-PCR).
Aanvendelse
Dette produkt kan bruges i vid udstrækning i ethvert eksperiment, hvor RNase-interferens er mulig for at undgå RNA-nedbrydning, såsom:
1.Syntese af den første streng af cDNA, RT-PCR, RT-qPCR osv.
2.Beskytter RNA mod nedbrydning under in vitro transkription/translation (f.eks. in vitro viralt replikationssystem).
3.Hæmning af RNase-aktivitet under RNA-separation og oprensning.
Opbevaringsbetingelser
Produktet kan opbevares ved -25～- 15 ℃, gyldigt i 2 år.
Opbevaringsbuffer
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7,6, 25 ℃), 8 mM DTT og 50 % glycerol.
Enhedsdefinition
Mængden af murin RNase-inhibitor, der var nødvendig for at inhibere aktiviteten af 5 ng ribonuklease A med 50 %, blev defineret som én enhed (U).
Molekylvægt af protein
Molekylvægten af murin RNase-inhibitor er 50 kDa.
Kvalitetskontrol
Exonuklease Aktivitet:
40 U murin RNase-hæmmer med 1 μg λ -Hind III-fordøjelses-DNA ved 37 ℃ i 16 timer giver ingen nedbrydning som bestemt ved agarosegelelektroforese.
Endonuklease aktivitet:
40 U murin RNase-inhibitor med 1 μ g λ DNA ved 37 ℃ i 16 timer giver ingen nedbrydning som bestemt ved agarosegelelektroforese.
Nicking Aktivitet:
40U murin RNase-inhibitor med 1μg pBR322 ved 37 ℃ i 16 timer giver ingen nedbrydning som bestemt ved agarosegelelektroforese.
RNase Aktivitet:
40U murin RNase-inhibitor med 1,6 μ g MS2 RNA i 4 timer ved 37 ℃ giver ingen nedbrydning som bestemt ved agarosegelelektroforese.
E.coli DNA:
40 U af murin RNase-hæmmer screenes for tilstedeværelsen af E. coli genomisk DNA ved hjælp af TaqMan qPCR med primere, der er specifikke for E. coli 16S rRNA-locuset.E. coli genomiske DNA-kontamination er ≤ 0,1 pg/40 U.
Nnotes
1. Voldsom svingning eller omrøring vil føre til enzyminaktivering.
2. Det optimale temperaturområde for denne inhibitor var 25-55 ℃, og den blev inaktiveret ved 65 ℃ og derover.
3. Aktiviteterne af RNase H, RNase 1 og RNase T1 blev ikke inhiberet af murin RNase-inhibitor.
4. Inhiberingen af RNase-aktivitet blev fundet i et bredt pH-område (pH 5-9 var alle aktive), og den højeste aktivitet blev observeret ved pH 7-8.
5. Da ribonukleaser typisk bevarer aktivitet under denaturerende betingelser, skal der udvises forsigtighed for at undgå denaturerende RNase-hæmmermolekyler, som har dannet kompleks med en ribonuklease.For at forhindre frigivelse af aktiv ribonuklease bør temperaturer over 50 °C og høje koncentrationer af urinstof eller andre denaturerende midler undgås.
