M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase er en revers transkriptase opnået ved mutationsscreening af M-MLV-genet af Moloney murine leukæmivirus oprindelse og ekspression i E.coli.Enzymet fjerner RNase H-aktivitet, har højere temperaturtolerance og er velegnet til højtemperatur revers transkription.Derfor er det nyttigt til at eliminere de ugunstige virkninger af RNA-højniveaustrukturen og ikke-specifikke faktorer på cDNA-syntese og har højere stabilitet og revers transkriptionssynteseevne.Enzymet har højere stabilitet og revers transkriptionssynteseevne.
Komponenter
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × First-Strand Buffer (valgfrit)
* 5 × First-Strand Buffer indeholder ikke dNTP, tilføj venligst dNTP'er, når du forbereder reaktionssystemet
Anbefalet anvendelse
1.Et-trins QRT-PCR.
2.Påvisning af RNA-virus.
Opbevaringstilstand
-20°C til langtidsopbevaring, bør blandes godt før brug, undgå hyppig frysning-optøning.
Enhedsdefinition
En enhed inkorporerer 1 nmol dTTP på 10 minutter ved 37°C ved anvendelse af poly(A)•oligo(dT)25som skabelon/primer.
Kvalitetskontrol
1.SDS-PAGE elektroforetisk renhed større end 98%.
2.Amplifikationsfølsomhed, batch-til-batch kontrol, stabilitet.
3.Ingen exogen nukleaseaktivitet, ingen exogen endonuklease eller exonukleasekontamination
Reaktionsopsætning for første kædereaktionsløsning
1.Fremstilling af reaktionsblandingen
| Komponenter | Bind |
| Oligo(dT)12-18 Primer eller Random Primer-en Eller genspecifikke primereb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Skabelon RNA | Total RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| RNase-fri dH2O | Til 10 μL |
Bemærkninger:a/b: Vælg venligst forskellige typer primere i henhold til dine eksperimentelle behov.
2.Opvarm ved 65°C i 5 minutter og afkøl hurtigt på is i 2 minutter.
3.Tilføj følgende komponenter til ovenstående system til et samlet volumen på 20µL og bland forsigtigt:
| Komponenter | Volumen (μL) |
| 5 × First-Strand Buffer | 4 |
| Neoscript omvendt transkriptase (200 U/μL) | 1 |
| RNase-hæmmer (40 U/μL) | 1 |
| RNase-fri dH2O | Til 20 μL |
4.Udfør venligst reaktionen i henhold til følgende betingelser:
(1) Hvis Random Primer anvendes, skal reaktionen udføres ved 25 ℃ i 10 minutter og derefter ved 50 ℃ i 30 ~ 60 minutter;
(2) Hvis der anvendes Oligo dT eller specifikke primere, skal reaktionen udføres ved 50 ℃ i 30~60 minutter.
5.Opvarm ved 95 ℃ i 5 minutter for at inaktivere Neoscript Reverse Transcriptase og afslutte reaktionen.
6.Omvendt transkriptionsprodukter kan bruges direkte i PCR-reaktion og fluorescenskvantitativ PCR-reaktion eller opbevares ved -20 ℃ i lang tid.
PCR Rhandling:
1.Fremstilling af reaktionsblandingen
| Komponenter | Koncentration |
| 10 × PCR-buffer (dNTP-fri, Mg²+ fri) | 1× |
| dNTP'er (10 mM hver dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA-polymerase (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Skabelon-en | ≤10 % første kædereaktionsopløsning (2 μL) |
| ddH2O | Til 50 μL |
Bemærkninger:a: Hvis der tilsættes for meget førstekædereaktionsopløsning, kan PCR-reaktionen hæmmes.
2.PCR-reaktionsprocedure
| Trin | Temperatur | Tid | Cykler |
| Præ-denaturering | 95℃ | 2-5 min | 1 |
| Denaturering | 95℃ | 10-20 sek | 30-40 |
| Udglødning | 50-60 ℃ | 10-30 sek | |
| Udvidelse | 72℃ | 10-60 sek |
Noter
1.Velegnet til omvendt transskriptionstemperaturoptimering i området 42℃~55℃.
2.Det har bedre stabilitet, er velegnet til højtemperatur revers transkriptionsamplifikation.Derudover er det gunstigt for effektivt at passere gennem komplekse strukturelle regioner af RNA.Også deter velegnet til et-trins multipleks fluorescens kvantitativ RT-PCR detektion.
3.God kompatibilitet med forskellige PCR-amplifikationsenzymer og er velegnet til højfølsomme RT-PCR-reaktioner.
4.Velegnet til højfølsom et-trins fluorescens kvantitativ RT-PCR-reaktion, forbedrer effektivt påvisningshastigheden for lav koncentration af skabeloner.
5.Velegnet til cDNA-bibliotekskonstruktion.
