Vaccinia Virus Capping Enzyme

Vaccinia-virus-capping-enzym er afledt af en rekombinant E. coli-stamme, der bærer generne for Vaccinia-capping-enzymet.Dette enkelt enzym er sammensat af to underenheder (D1 og D12) og har tre enzymatiske aktiviteter (RNA triphosphatase og guanylyltransferase af D1 underenheden og guanin methyltransferase af D12 underenheden).Vaccinia virus Capping Enzyme er effektivt til at katalysere dannelsen af ​​cap-struktur, som specifikt kan binde 7-methylguanylat cap-strukturen (m7Gppp, Cap 0) til 5'-enden af ​​RNA.Cap-struktur (Cap 0) spiller en vigtig rolle i mRNA-stabilisering, transport og translation i eukaryoter.Afdækning af RNA ved enzymatisk reaktion er en effektiv og enkel metode, som markant kan forbedre stabiliteten og translationen af ​​RNA til in vitro transkription, transfektion og mikroinjektion.

Komponenter

Vaccinia Virus Capping Enzyme (10 U/μL)

10×Capping buffer

Opbevaringsforhold

-25～- 15℃ til opbevaring （ Undgå gentagne fryse-tø-cyklusser）

Opbevaringsbuffer

20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCI,

1 mM DTT, 0, 1 mM EDTA, 0, 1 % Triton X-100, 50 % glycerol.

Enhedsdefinition

En enhed af Vaccinia virus Capping Enzyme er defineret som den mængde enzym, der kræves for at inkorporere 10 pmol GTP i et 80nt transkript på 1 time ved 37°C.

Kvalitetskontrol

Exonuklease:10U Vaccinia virus-capping-enzym med 1μg λ-Hind III-fordøjelses-DNA ved 37 ℃ i 16 timer giver ingen nedbrydning som bestemt ved agarosegelelektroforese.

Endonuklease:10U Vaccinia virus-capping-enzym med 1μg λDNA ved 37 ℃ i 16 timer giver ingen nedbrydning som bestemt ved agarosegelelektroforese.

Nickase:10U Vaccinia virus-capping-enzym med 1 μg pBR322 ved 37 ℃ i 16 timer giver ingen nedbrydning som bestemt ved agarosegelelektroforese.

RNase:10U Vaccinia virus-capping-enzym med 1,6 μg MS2 RNA i 4 timer ved 37 ℃ giver ingen nedbrydning som bestemt ved agarosegelelektroforese.

1.coli DNA:10 U af Vaccinia virus Capping Enzyme screenes for tilstedeværelsen af ​​E. coli genomisk DNA ved hjælp af TaqMan qPCR med primere, der er specifikke for E. coli 16S rRNA locus.Den genomiske E. coli-DNA-kontamination er ≤1 E. coli-genom.

2.Bakteriel Endotoksin: LAL-test, ifølge Chinese Pharmacopoeia IV 2020-udgave, gelgrænsetestmetode, generel regel (1143).Bakterielt endotoksinindhold bør være ≤10 EU/mg.

Reaktionssystem og betingelser

1. Capping Protocol (reaktionsvolumen: 20 μL)

Denne procedure er anvendelig til capping-reaktionen af ​​10μg RNA (≥100 nt), og den kan skaleres op i henhold til eksperimentelle krav.

I) Kombiner 10 μg RNA og nukleasefri H2O i et 1,5 ml mikrofugerør til et slutvolumen på 15,0 μL.*10×Capping-buffer: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

2) Opvarm ved 65 ℃ i 5 minutter efterfulgt af isbad i 5 minutter.

3) Tilføj følgende komponenter i den angivne rækkefølge

*10×Capping-buffer: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

4) Inkuber ved 37°C i 30 minutter, RNA er nu lukket og klar til nedstrømsapplikationer.

2. 5′ terminal mærkningsreaktion (reaktionsvolumen: 20 μL)

Denne protokol er designet til at mærke RNA indeholdende et 5' trifosfat, og det kan skaleres op efter behov.Effektiviteten af ​​etiketinkorporering vil blive påvirket af molforholdet mellem RNA: GTP, såvel som GTP-indholdet i RNA-prøver.

1) Kombiner passende mængde RNA og nukleasefri H2O i et 1,5 ml mikrofugerør til et slutvolumen på 14,0 µL.

2) Opvarm ved 65 ℃ i 5 minutter efterfulgt af isbad i 5 minutter.

3) Tilføj følgende komponenter i den angivne rækkefølge.

** GTP MIX refererer til GTP og et lille antal markører.For koncentrationen af ​​GTP, setil note 3.

4) Inkuber ved 37°C i 30 minutter, RNA 5′-enden er nu mærket og klar til nedstrøms

Ansøgninger

1. Afdækning af mRNA før translationsassays/in vitro translation

2. Mærkning af 5'-enden af ​​mRNA

Noter om brug

1.Opvarmning af opløsningen af ​​RNA før inkubation med Vaccinia Capping Enzyme fjerner sekundær struktur på 5'enden af ​​transkriptet.Forlæng tiden til 60 minutter for transskriptioner med kendte meget strukturerede 5'ender.

2. RNA, der bruges til capping-reaktioner, skal renses før brug og suspenderes i nukleasefrit vand.EDTA bør ikke være til stede, og opløsningen bør være fri for salte.

3. Til mærkning af 5´-enden skal den totale GTP-koncentration være omkring 1-3 gange den molære koncentration af mRNA i reaktionen.

4. Reaktionssystemets volumen kan skaleres op eller ned alt efter det faktiske.