RTL omvendt transkriptase
RTL revers transkriptase er en RNA-skabelonafhængig DNA-polymerase, der mangler 3'→5' exonukleaseaktiviteten og har RNase H-aktivitet.Dette enzym kan bruge RNA som skabelon til at syntetisere en komplementær streng af DNA, som kan anvendes til førstestrengs cDNA-syntese, især til RT-LAMP (loop-medieret isotermisk amplifikation).Sammenlignet med RTL revers transkriptase 1.0 er følsomheden væsentligt forbedret, den termiske stabilitet er stærkere, og reaktionen ved 65°C er mere stabil.RTL revers transkriptase (glycerolfri) kan bruges til at fremstille frysetørrede præparater, frysetørrede RT-LAMP-reagenser osv.
Enhedsdefinition
En enhed inkorporerer 1 nmol dTTP i syrepræcipiterbart materiale på 20 minutter ved 50°C under anvendelse af poly(A)•oligo(dT)25 som template-primer.
Komponenter
| Komponent | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL omvendt transkriptase (glycerolfri) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL Buffer | 1,5 ml | 4×1,5 ml | 5×10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2×1,5 ml | 3×10 ml |
Opbevaringstilstand
Transport under 0°C og opbevares ved -25°C~-15°C.
Kvalitetskontrol
- Restaktivitet afEndonuklease:En 50 μL reaktion indeholdende 1 μg λDNA og 15 enheder RTL2.0 inkuberet i 16 timer ved 37 ℃ viser samme mønster som negativ kontrol ved gelelektroforese.
- Restaktivitet afExonuklease:En 50 μL reaktion indeholdende 1 μg Hind Ⅲ-fordøjet λDNA og 15 enheder RTL2.0 inkuberet i 16 timer ved 37 ℃ viser samme mønster som negativ kontrol ved gelelektroforese.
- Restaktivitet afNickase:En 50 μL reaktion indeholdende 1 μg supercoiled pBR322 og 15 enheder RTL2.0 inkuberet i 4 timer ved 37°C viser samme mønster som negativ kontrol ved gelelektroforese.
- Restaktivitet afRNase:En 10 μL reaktion indeholdende 0,48 μg MS2 RNA og 15 enheder RTL2.0 inkuberet i 4 timer ved 37°C viser samme mønster som negativ kontrol ved gelelektroforese.
- E coli gDNA:Målt medE colispecifikke HCD-detektionssæt, 15 enheder RTL2.0 indeholder mindre end 1E coligenom.
Reaktionsopsætning
cDNA-synteseprotokol
| Komponenter | Bind |
| Skabelon RNA a | valgfri |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) eller Random Primer mix (60uM) | 2 μL |
| dNTP Mix (10 mM hver) | 1 μL |
| RNase-hæmmer (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL Buffer | 2 μL |
| Nukleasefrit vand | Op til 20 μL |
Bemærkninger:
1) Den anbefalede dosis af Total RNA er 1ng~1μg
2) Den anbefalede dosis af mRNA var 50 ng~100 ng
Termo-cykling Betingelser for en rutine reaktion:
| Temperatur (°C) | Tid |
| 25 °Ca | 5 min |
| 55 °C | 10 minb |
| 80 °C | 10 min |
Bemærkninger:
1) Hvis Random Primer Mix anvendes, et inkubationstrin ved 25°C.
2) Hvis der anvendes målprimerblanding, et inkubationstrin ved 55°C i 10~30 minutter.
RT-LAMP-protokol
| Komponenter | Bind | Endelig koncentration |
| Skabelon RNA | valgfri | ≥10 eksemplarer |
| dNTP-mix (10 mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| FIP/BIP-primere (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| F3/B3 Primere (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| LoopF/LoopB Primere (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| RNase-hæmmer (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Reaktion |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U/Reaktion |
| Bst V2 DNA-polymerase (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reaktion |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (i alt 8 mM) |
| 10×HC RTL-buffer (eller 10×HC Bst V2-buffer) | 2,5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Nukleasefrit vand | Op til 25 μL | - |
Bemærkninger:
1) Bland ved vortexing og centrifuger kort for at opsamle.Konstant temperaturinkubation ved 65°C i 1 time.
2) De to buffere er interoperable og har samme sammensætning.
Noter
1. Dette produkt vil danne et hvidt fast stof, når det opbevares ved -20 °C.Tag den ud fra -20°C og læg den på is i cirka 10 minutter.Efter smeltning kan den bruges ved at ryste og blande.
2. cDNA-produktet kunne opbevares ved -20°C eller -80°C eller anvendes straks til PCR-reaktion.
3.For at forhindre RNase-kontamination, bedes du holde forsøgsområdet rent, og bære rene handsker og masker under drift.
