PNGase F
Peptid-N-Glycosidase F(PNGase F) er den mest effektive enzymatiske metode til at fjerne næsten alle N-bundne oligosaccharider fra glycoproteiner.PNGase F er en amidase, som spalter mellem de inderste GlcNAc- og asparaginrester af høj mannose-, hybrid- og komplekse oligosaccharider fra N-bundne glycoproteiner.
Ansøgning
Dette enzym er nyttigt til fjernelse af kulhydratrester fra proteiner.
Forberedelse og specifikation
| Udseende | Farveløs væske |
| Protein renhed | ≥95 % (fra SDS-PAGE) |
| Aktivitet | ≥500.000 U/ml |
| Exoglycosidase | Ingen aktivitet kunne detekteres (ND) |
| Endoglycosidase F1 | ND |
| Endoglycosidase F2 | ND |
| Endoglycosidase F3 | ND |
| Endoglycosidase H | ND |
| Protease | ND |
Ejendomme
| EF-nummer | 3.5.1.52(Rekombinant fra mikroorganisme) |
| Molekylær vægt | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Isoelektrisk punkt | 8. 14 |
| Optimal pH | 7,0-8,0 |
| Optimal temperatur | 65 °C |
| Substratspecificitet | Spaltning af glykosidbindinger mellem GlcNAc og asparaginrester Fig |
| Anerkendelsessteder | N-bundne glycaner, medmindre de indeholder α1-3 fucose Fig. 2 |
| Aktivatorer | DTT |
| Inhibitor | SDS |
| Stuetemperatur | -25 ~-15 ℃ |
| Varme inaktivering | En 20 µL reaktionsblanding indeholdende 1 µL PNGase F inaktiveres ved inkubation ved 75 °C i 10 minutter. |
Fig. 1 Substratspecificitet af PNGase F
Fig. 2 Genkendelse af PNGase F.
Når de interne GlcNAc-rester er bundet til α1-3-fucose, kan PNGase F ikke spalte N-bundne oligosaccharider fra glycoproteiner.Denne modifikation er almindelig hos planter og nogle insektglykoproteiner.
Componenter
|
| Komponenter | Koncentration |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10×Glycoprotein Denaturing Buffer | 1000 µl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Enhedsdefinition
En enhed(U) er defineret som den mængde enzym, der kræves for at fjerne >95% af kulhydratet fra 10 µg denatureret RNase B på 1 time ved 37°C i et totalt reaktionsvolumen på 10 µL.
Reaktionsbetingelser
1.Opløs 1-20 µg glycoprotein med deioniseret vand, tilsæt 1 µl 10×Glycoprotein Denaturing Buffer og H2O (om nødvendigt) for at lave et totalt reaktionsvolumen på 10 µl.
2.Inkuber ved 100°C i 10 minutter, afkøl det på is.
3.Tilsæt 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 og bland.
4.Tilsæt 1-2 µl PNGase F og H2O (om nødvendigt) for at lave et totalt reaktionsvolumen på 20 µl og bland.
5.Inkuber reaktionen ved 37°C i 60 min.
6.Til SDS-PAGE-analyse eller HPLC-analyse.
