mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2'-O-methyltransferase blev afledt af en rekombinant E. coli-stamme, der bærer genet for vaccinia mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase.Dette enzym tilføjer en methylgruppe ved 2'-O-positionen af ​​det første nukleotid, der støder op til cap-strukturen ved 5'-enden af ​​RNA'et. Enzymet anvender S-adenosylmethionin (SAM) som en methyldonor til at methylere capped RNA (cap). -0), hvilket resulterer i en cap-1 struktur.

Cap1-strukturen kan øge translationseffektiviteten, hvilket forbedrer ekspressionen af ​​mRNA i transfektions- og mikroinjektionsforsøg. Dette enzym kræver specifikt RNA med en m7GpppN-hætte som substrat.Det kan ikke bruge RNA med pN, ppN, pppN eller GpppN i 5´-enden.Capped RNA kan fremstilles via in vitro-transkription under anvendelse af cap-analog eller gennem enzymatisk capping ved anvendelse af Vaccinia Capping Enzyme.

Komponenter

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)

10×Capping-reaktionsbuffer

Opbevaring

-25 ～- 15 ℃ til opbevaring （ Undgå gentagne fryse-tø-cyklusser）

Opbevaringsbuffer

20 mM Tris-HCl (pH 8,0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 50 % glycerol.

Enhedsdefinition

Én enhed er defineret som mængden af ​​enzym, der kræves for at methylere 10 pmol af 80 nt capped RNA-transkript på 1 time ved 37°C.

Kvalitetskontrol assays

Exonuklease:50U mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase med 1μg λ-Hind III-fordøjelses-DNA ved 37 ℃ i 16 timer giver ingen nedbrydning som bestemt ved agarosegelelektroforese.

Endonuklease: 50 U mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase med 1 μg λDNA ved 37 ℃ i 16 timer giver ingen nedbrydning som bestemt ved agarosegelelektroforese.

Nickase: 50U mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase med 1μg pBR322 ved 37 ℃ i 16 timer giver ingen nedbrydning som bestemt ved agarosegelelektroforese.

RNase: 50U mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase med 1,6 μg MS2 RNA i 4 timer ved 37 ℃ giver ingen nedbrydning som bestemt ved agarosegelelektroforese.

E. coli DNA: 50U mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase screenes for tilstedeværelse afE. coli genomisk DNA ved hjælp af TaqMan qPCR med primere, der er specifikke forE. coli 16S rRNA locus.DetE. coli genomisk DNA-kontamination er =1E. coli genom.

Bakteriel Endotoksin: LAL-test, ifølge Chinese Pharmacopoeia IV 2020-udgave, gelgrænsetestmetode, generel regel (1143).Bakterielt endotoksinindhold bør være =10 EU/mg.

Reaktionssystem og betingelser

1. Kombiner en passende mængde Capped RNA og RNase-fri H2O i et 1,5 mL mikrofugerør til et slutvolumen på 16,0 µL.

2. Opvarm ved 65 ℃ i 5 minutter efterfulgt af et isbad i 5 minutter.

3. Tilføj følgende komponenter i den specificerede rækkefølge (til methylering af Capped RNA

mindre end 10

*10× Capping Reaction Buffer: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Inkuber ved 37 ℃ i 1 time (2 timers inkubation anbefales for målfragmentet mindre end 200 nt).

Ansøgninger

For at forbedre mRNA-ekspression under mikroinjektion og transfektionseksperimenter.

Noter om brug

1. Før reaktion skal RNA renses og opløses i nukleasefrit vand, alle opløsningerne bør ikke indeholde EDTA og ioner.

2. Det anbefales at opvarme prøve-RNA'et ved 65 ℃ i 5 minutter før reaktionen for at fjerne den sekundære struktur på 5'-enden af ​​transkriptet.Det kunne forlænges til 10 minutter for kompleks 5'-terminal struktur.