Dobbeltstrenget RNA (dsRNA) ELISA KIT

Dette kit er en Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kobling med biotin-Streptavidin system til kvantitativ måling af dsRNA med en længde på over 60 basepar (bp), uanset sekvensen.Pladen er blevet præcoatet med anti-dsRNA-antistof.dsRNA, der er til stede i prøven, tilsættes og binder til antistoffer belagt på brøndene.Og derefter tilsættes biotinyleret anti-dsRNA-antistof og binder til dsRNA i prøven.Efter vask tilsættes HRP-Streptavidin og binder til det biotinylerede anti-dsRNA-antistof.Efter inkubation vaskes ubundet HRP-Streptavidin væk.Derefter tilsættes TMB-substratopløsning og katalyseres af HRP til fremstilling af et blåt farveprodukt, der ændrede sig til gult efter tilsætning af sur stopopløsning.Tætheden af ​​gul er proportional med målmængden af ​​dsRNA fanget i pladen.Absorbansen måles ved 450 nm.

Ansøgning

Dette sæt er til kvantitativ måling af resterende dsRNA.

Sættets komponenter

Opbevaring og stabilitet

1. For ubrugt kit: Hele kittet kan opbevares ved 2~8 ℃ i holdbarhed.Stærkt lys bør undgås for opbevaringsstabilitet.

2. Til brugt sæt: Når mikropladen er åbnet, skal du dække ubrugte brønde med pladeforsegler og returnere til folieposen, der indeholder tørremiddelpakken, lynlås folieposen og returnere til 2~8℃ så hurtigt som muligt efter brug.Andre reagenser skal returneres til 2~8℃ så hurtigt som muligt efter brug.

Nødvendige materialer, men ikke leveret

1. Mikropladelæser med 450±10nm filter (bedre hvis kan detektere ved 450 og 650 nm bølgelængde).

2. Mikropladeryster.

3. RNase-fri spidser og centrifugerør.

Driftsrutediagram

Før du begynder

1. Bring alle kitkomponenter og prøver til stuetemperatur (18-25 ℃) før brug.Hvis sættet ikke bliver brugt op på én gang, skal du kun tage strimler og reagenser ud til det nuværende eksperiment, og efterlade de resterende strimler og reagenser i den nødvendige tilstand.

2. Vaskebuffer: fortynd 40mL 20x koncentreret vaskebuffer med 760mL deioniseret eller destilleret vand for at fremstille 800mL 1x vaskebuffer.

3. Standard: Spin eller centrifuger kortvarigt stamopløsningen før brug.Koncentrationen af ​​fire standarder er 5ng/μL.For UTP- og pUTP-dsRNA-standarder skal du fortynde stamopløsningen til 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0 pg/μL med STE-buffer for at tegne standardkurven.For N1-Me-pUTP dsRNA-standarder skal du fortynde stamopløsningen til 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL med STE-buffer for at tegne standardkurven.For 5-OMe-UTP dsRNA-standard skal du fortynde stamopløsningen til 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0pg/μL med STE-buffer for at tegne standardkurven.Vi anbefaler, at standarder kan fortyndes som følgende diagrammer:

4. Biotinyleret detektionsantistof og HRP-streptavidin-arbejdsopløsning: Spin eller centrifuger stamopløsningen kort før brug.Fortynd dem til arbejdskoncentrationen med fortyndingsbuffer.

5. TMB-substate: Aspirer den nødvendige dosis af opløsningen med steriliserede spidser og dump ikke den resterende opløsning i hætteglasset igen.TMB-substaten er følsom over for lys, udsæt ikke TMB-substratet for lys i lang tid.

Brug af protokol

1. Bestem det antal strimler, der kræves til analysen.Indsæt strimlerne i rammerne til brug.Resterende pladestrimler, der ikke er brugt i denne analyse, skal pakkes om i posen med tørremiddel.Luk posen tæt til opbevaring i køleskab.

2. Tilsæt 100 μL af hver fortynding af standard, blindprøve og prøver i de relevante brønde.Dæk med pladeforsegleren.Inkuber i 1 time ved stuetemperatur under omrystning ved 500 rpm.Prøverne skal fortyndes med STE-buffer til passende koncentration for nøjagtig analyse.

3. Vasketrin: Aspirer opløsningen og vask med 250μL vaskebuffer til hver brønd, og lad den stå i 30 sekunder.Kassér vaskebuffer helt ved at klikke pladen på absorberende papir.Vaskes totalt 4 gange.

4. Tilsæt 100μL biotinyleret detektionsantistofarbejdsopløsning i hver brønd.Dæk med pladeforsegleren.Inkuber i 1 time ved stuetemperatur under omrystning ved 500 rpm.

5. Gentag vasketrinnet.

6. Tilsæt 100 μL HRP-streptavidin-arbejdsopløsning i hver brønd.Dæk med pladeforsegleren.Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur under omrystning ved 500 rpm.

7. Gentag vasketrin igen.

8. Tilsæt 100 μL TMB-substratopløsning i hver brønd.Dæk med pladeforsegleren.Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur. Beskyt mod lys.Væsken bliver blå ved tilsætning af substratopløsning.

9. Tilsæt 50 μL stopopløsning i hver brønd.Væsken bliver gul ved tilsætning af stopopløsning.Kør derefter mikropladelæseren og foretag måling ved 450 nm med det samme.

Beregning af resultater

1. Tag et gennemsnit af duplikataflæsningerne for hver standard, kontrol og prøver, og fratræk den gennemsnitlige optiske standardtæthed på nul.Konstruer en standardkurve med absorbans på den lodrette(Y)-akse og dsRNA-koncentration på den vandrette(X）-akse.

2. Det anbefales at udføre beregningen med computerbaseret kurvetilpasningssoftware såsom kurveekspert 1.3 eller ELISA Calc i en 5 eller 4 parameter ikke-lineær tilpasningsmodel.

Ydeevne

1. Følsomhed:

nedre detektionsgrænse: ≤ 0,001 pg/μL (for UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (for 5-OMe-UTP-dsRNA).

nedre grænse for kvantificering: 0,0156 pg/μL (for UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (for N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (for 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Præcision: CV af Intra-Assay ≤10%, CV af Inter-Assay ≤10%

3. Gendannelse: 80%~120%

4.Linearitet:0,0156-0,5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0,0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA),0,0625-1pg/μL(for 5-OMe-UTP-dsRNA).

Overvejelser

1. TMB reaktionstemperatur og tid er kritisk, kontroller dem venligst i henhold til instruktionerne strengt.

2. For at opnå god analysereproducerbarhed og følsomhed er korrekt vask af pladerne for at fjerne overskydende ikke-reagerede reagenser afgørende.

3. Alle reagenser skal blandes grundigt før brug og undgå bumbles under prøve- eller reagenstilsætning.

4. Hvis der er dannet krystaller i den koncentrerede vaskebuffer (20x), opvarmes til 37 ℃ og blandes forsigtigt, indtil krystallerne er helt opløst.

5. Undgå assay af prøver, der indeholder natriumazid (NaN3), da det kan ødelægge HRP-aktiviteten, hvilket resulterer i undervurdering af mængden af ​​dsRNA.

6. Undgå RNase-kontamination under assay.

7. Standarden/prøven, detektionsantistoffet og SA-HRP kan også udføres ved RT uden omrystning, men dette kan forårsage det ene gange faldende detektionsfølsomhed.I dette tilfælde anbefaler vi, at UTP- og pUTP-dsRNA-standarder skal fortyndes fra 2pg/μL, N1-Me-pUTP dsRNA-standarder skal fortyndes fra 4pg/μL, og 5-OMe-UTP dsRNA-standarder skal fortyndes fra 8pg/μL.Derudover inkuber HRP-streptavidin arbejdsopløsning i 60 minutter ved stuetemperatur.Brug ikke en kolberyster, da en kolberyster kan resultere i et unøjagtigt resultat.

Typisk resultat

1. Standardkurvedata

2. Standardkurveberegning

3. Liner detektionsområde: 0,0312- 1pg/μL